ここでは、コムギ胚芽ベースのin vitro翻訳システムで合成されたYFPタグ付きGagと電気形成技術によって調製されたGUVを使用して、HIV-1 Gagと脂質膜との間の相互作用を視覚的に分析するin vitro膜結合アッセイを示します。
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この記事について
サマリー
要約
HIV-1の構造タンパク質、Pr55 のGag（またはギャグ）は、ウイルスの組立プロセス中に細胞内で原形質膜に結合します。ギャグの膜結合は、ウイルス粒子産生の重度の障害でギャグ膜結合結果の欠陥以来、ウイルス粒子形成に必須の工程です。ギャグ脂質膜との相互作用のメカニズムの詳細は、NMRに基づくインビトロ方法を得るために、タンパク質フットプリント、表面プラズモン共鳴、リポソーム浮遊遠心分離、又は蛍光脂質ビーズ結合は、これまで開発されてきました。しかし、これらのin vitroの方法の各々は、その限界を有します。これらの制限の一部を克服し、以前に確立された方法に相補的なアプローチを提供するために、我々は、 インビトロアッセイを開発したHIV-1 Gagおよび脂質膜との相互作用」とは、細胞のような」環境で行われます。このアッセイでは、脂質膜に結合したGag目視YFP-taggeを用いて分析しますDのギャグは、電鋳技術により調製インビトロ翻訳システムとGUVs に小麦ベースの胚芽で合成します。ここでは、アッセイのために必要なミリストイル化完全長Gagタンパク質とGUV膜を得るために、およびGag-GUVは顕微鏡によって結合を検出するために、背景とプロトコルについて説明します。
概要
ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）は、組み立ておよび大部分の細胞型における原形質膜（PM）から芽エンベロープウイルスです。 HIV-1ウイルス粒子のアセンブリは、Pr55 ギャグ （GAG）と呼ばれる55 kDaのウイルスコアタンパク質によって駆動されます。ギャグは、4つの主要な構造ドメイン、すなわち、マトリックス、カプシド、ヌクレオカプシド、およびP6、ならびに2のスペーサーペプチドSP1およびSP2で構成される前駆体ポリタンパク質として合成されます。組み立て中、マトリックス（MA）ドメインは、組立現場にギャグのターゲティングのために責任がある、カプシド（CA）ドメインはギャグ・ギャグの相互作用を媒介する、ヌクレオカプシド（NC）ドメインは、ウイルスゲノムRNAを募集し、p6の新兵の宿主因子を助けます原形質膜からのウイルス粒子の切断。 GAGはまた、N末端に14炭素脂肪酸またはミリスチン部分の添加により、共翻訳後修飾を受けます。
ギャグの結合膜はメートル以来、ウイルスのアセンブリのために不可欠な要件でありますウイルス粒子を産生しない膜結合に欠陥があるutants。我々と他の人はギャグの結合膜はMAドメイン内の二部の信号によって媒介されることが示されている：脂質二重層や高塩基性領域（と呼ばMAドメイン内の塩基性残基のクラスターとの疎水性相互作用を媒介N末端ミリスチン酸部分PM 1-4上の酸性脂質と相互作用HBR）。ポリリン酸化イ....
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プロトコル
1日目：小麦胚芽溶解物ベースのin vitro転写・翻訳システムを用いたGagタンパク質の発現
HIV-1のGagの調製
- 冷凍庫から商業小麦胚芽CECFキットの全ての試薬を取り外します（小麦胚芽溶解物を-80ºCで保存されている。-20ºCで他の試薬）。氷の上で解凍し、 表1に示す成分を混合。
| ミックス-1（摂食ミックス） | |
| 供給溶液 | 900μlの |
| アミノ酸 | 80μlの |
| メチオニン | 20μlの |
| 合計 | 千μlの |
| ミックス-2（溶解物ミックス） | |
| 小麦胚芽溶解物 |
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結果
上記のプロトコルを使用して、我々は、POPC + POPS +チョルから成るGUVsを用意し（モル比：4.66：2.33：3）。この組成物は、約PMのPSおよびコレステロール濃度を反映するために選ばれました。ギャグの堅牢かつ効率的な結合は、脳-PI（4,5）P 2は、POPC + POPS + Cholの混合物（POPC + POPS +チョル+脳-PI（4,5）P 2 [モル比に含まれていた場合にのみ観察されました：4：2：3：1]この例では）（ 図4、A及びC）とパネルBとDを比較します。 POPC + POPS +チョル+脳-PI（4,5）P 2から成るGUVsに結合GAG-YFPは、膜表面上の蛍光強度の増加によって明らかです。この増加は、GUV境界（ 図4CおよびDのX-X '）を横切る線に沿って蛍光強度プロファイル（ 図4、下）に見ることができ.......
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ディスカッション
上記のようにGUV結合アッセイは、他のタンパク質 - 脂質相互作用アッセイは、その限界を持っているシナリオでは良い代替手段を提供します。このアッセイは、私たちは、脂質二重層の文脈における天然の長さのアシル鎖を有するミリストイル化完全長Gagおよび酸性脂質間の相互作用を検討およびGag-脂質の高密度ショ糖勾配または他のポスト結合処理により長い浮上遠心分離することなく、そうすることができます複合体。別の利点は、ギャグの動作を容易に、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイのような他のリアルタイム技術で実現されていない複雑な混合物（ 例えば 、細胞質ゾル成分の存在下）で調べることができることです。したがって、一つはここに記載のアッセイは、フィールドで使用される他のアッセイよりネイティブのコンテキスト内のGag-酸性脂質相互作用のリアルタイムの評価を可能にすることを主張することができます。
しかし、のような方法に関連する制限がありますよく。所与の製剤中GUVsが互いに類似の組成を有し、元の混合物に、電鋳をよく混合25,26中に存在する最も高い転移温度を.......
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開示事項
私たちは、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
私たちは便利な議論のためのモハンマドサリーム、ジン呉とクリシュナンRaghunathanに感謝したいと思います。また、撮影中に支援するためのプリヤBeganiに感謝します。この作品は、国立衛生研究所R01 AI071727（AO）と（SLV）はR01 GM110052を付与することによってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| デジタルマルチメータ | Meterman | 30XR | 抵抗とボルトを測定できる汎用マルチメータは、その目的を果たします。 |
| ファンクションジェネレータ | Instek | GFG-8216A | 10Hzと1Vの正弦波を生成できる汎用ファンクションジェネレータで十分です。 |
| ITOコーティングされたガラススライド | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| インキュベーター | Hoefer | 温度を正確に維持できるインキュベーターは十分です | |
| 真空チャンバー | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| シリンジ | ハミルトン | 80400 | ゲージ 22S, シリンジ番号 702 |
| PDMS | Sylgard エラストマー ベース キット、Dow-Corning | Sylgard、184 | |
| RTS 100 小麦胚芽 CECF キット | BiotechRabbit、 ベルリン、ドイツ | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州 | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids、アラバスター、アラバスター | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| コレステロール | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | アバンティポーラーリピッド | 840046X |
参考文献
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
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再版と許可
