Abstract
Säugerzellkultur in Monolayern wird weithin verwendet, um verschiedene physiologische und molekulare Prozesse zu untersuchen. dieser Ansatz jedoch zu wachsenden Zellen studieren erzeugt oft unerwünschte Artefakte. Daher Zellkultur in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung, die oft extrazelluläre Matrixkomponenten verwenden, erwies sich als eine interessante Alternative wegen seiner Ähnlichkeit mit dem nativen in vivo Gewebe oder Organ. Wir entwickelten ein Kultursystem 3D - Zelle zwei Abteilen unter Verwendung, nämlich (i) eine zentrale Kammer Krebszellen enthält , in einem Kollagengel wirkenden eingebettet als pseudo-primäre macrospherical Tumors und (ii) einem peripheren zellfreien Kammer aus einem Fibrin - Gel, dh eine extrazelluläre Matrixkomponente , die sich von der in der Mitte verwendet werden, in denen Krebszellen (invasion vorne) wandern und / oder mikrosphärischen Tumoren bilden darstellt sekundäre oder Satelliten Tumoren. Die Bildung von Satelliten-Tumoren im peripheres Kompartiment istbemerkenswert korreliert mit der bekannten Aggressivität oder metastasiertem Ursprung der nativen Tumorzellen, die diese 3D-Kultursystem einzigartig macht. Dieser Zellkulturansatz könnte als Krebszelle Invasivität und Motilität, Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen und als ein Verfahren zur Beurteilung anti-Krebs-Medikament Eigenschaften zu bewerten.
Introduction
Die grundlegenden und biomedizinischen Eigenschaften der Invasion von Krebszellen / Migration und anschließende Metastasierung Einrichtung zu untersuchen , ist Gegenstand einer intensiven Forschung 1,2. Metastasierung ist die letzte Stufe der Krebs und seine klinische Management bleibt schwer zu fassen. Ein besseres Verständnis der Metastasierung auf zellulärer und molekularer Ebene wird die Entwicklung effizienterer Therapien 3 ermöglichen.
Mehrere Eigenschaften von metastatischen Zellen können in vitro 4 einschließlich ihrer stemness und potentielle einen Übergangszustand (beispielsweise epithelioid-mesenchymale Transition) zu migrieren und dringen in und aus dem Primärtumor 5 zu erwerben , untersucht werden. Allerdings hat die in - vitro - Beurteilung der Invasion / Metastasierung Prozesse eine Herausforderung , da sie praktisch den Beitrag des Blut / lymphatischen Kreislauf schließt. Organotypischen Kulturen, die Tumorfragmente in Collagengele einbetten haben früschlauen verwendet worden, um Krebs Aggressivität zu überwachen. Obwohl die Komplexität von Tumoren erhalten wird (beispielsweise das Vorhandensein von Nicht-Krebszellen) werden Tumorfragmente des begrenzten Diffusionsmedium ausgesetzt wird , um Stichprobenvariation und zu einem übermäßigen Wachstum von Stromazellen 6. Ein alternatives Verfahren besteht in Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) in Krebszellen wachsen, die die dreidimensionale (3D) Zellumgebung imitiert. Die Proliferation von Brustkrebszelllinien in einem Kollagen-Gel und / oder einer Basalmembran-Matrix abgeleitet ist unter den besten charakterisierten Beispiele von 3D-Zellkultur. Durch die Verwendung von bestimmten 3D - Zellkulturumgebungen, die desorganisierte Anordnung für Brustkrebszellen beobachtet unter Standardbedingungen gezüchtet kann 7-10 zur spontanen Bildung von Brust Acini und röhrenförmige Strukturen umgekehrt werden. Darüber hinaus sammelten die Bildung von vielzelligen Tumorsphäroide abgeleitet von einem Adenokarzinom Krebszellen mit verschiedenen Techniken (zB hängende Tropfen, schwimmend Sphäroiden, Agar Einbettungs) jetzt die am häufigsten verwendeten 3D - Zellkulturtest 11-13 darstellt. Jedoch ist dieser Test durch den eingeschränkten Satz von Krebszelllinien begrenzt, die Sphäroide und durch den kurzen Zeitraum zur Verfügung zu studieren Zellen unter diesen Bedingungen bilden kann.
In dieser visualisierten Technik stellen wir hier ein anspruchsvolles 3D - Zellkulturassay , wo Krebszellen von Interesse in einem Kollagengel eingebettet sind , die in vitro Bildung eines pseudo-primären Tumors zu ermöglichen , die mit einer Basalmembran stammenden Matrix beschichtet werden alternativ kann. Einmal gebildet, wird die pseudo-primären Tumors dann in einer azellulären Matrix (Fibrin - Gel im vorliegenden Fall) sandwichartig angeordnet, die die Krebszellen ermöglicht die Schnittstelle zwischen den beiden Abteilen Matrix kreuzen (siehe Abbildung 1). Interessanterweise sekundäre tumorartige Strukturen aus dem Pseudo-Primärtumor erscheinen zusammen mit aggressiven Krebszellen mit Ursprung in derFibrin-Gel. Eine solche 3D - Kultursystem bietet die Flexibilität , beispielsweise zu untersuchen, erforderlich, Antikrebsmittel, die Genexpression und die Zell-Zell- und / oder Zell-ECM - Wechselwirkungen 14-16.
Abbildung 1:.. Überblick über die Methode Schematische Zusammenfassung der Methode der 3D - Zellkultursystem als Modell für Krebsstudien zu generieren Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Protocol
HINWEIS: Keine Ethik Betracht, da tierische und menschliche Krebszellen erworben wurden oder uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt.
1. Erstellen Collagen Stecker (Pseudo-Primärtumor)
- Bereiten Sie eine Kollagen-Dispersion. Typ I aus Rattenschwanzsehnen (RTT) Kollagen kann entweder extrahiert und sterilisiert werden , wie zuvor 17 berichtet, oder gekauft haben . Disperse gefriergetrocknet RTT Kollagen (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N Essigsäure) mit einem Mixer (High-Speed-Einstellung, fünf 2 min läuft) für eine gleichmäßige Durchmischung.
- Harvest (Trypsin-EDTA, in der Regel) und verwenden Trypanblau-Ausschluss für das Zählen lebender Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Stellen Sie die gewünschte Zelldichte (5 x 10 4 Zellen pro Stecker).
- Bereiten Sie alle Lösungen (NaOH, fötale Rinderserum, DMEM 5x, NaHCO 3) getrennt (Tabelle 1) unter sterilen Bedingungen und gekühlt auf Eis halten. Anmerkung: Die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Lösungen wichtig ist osmotischen Schocks oder saure in Zellen zu verhindern.
- Führen Zelldispersion (1,25 x 10 & sup6 ; Zellen) in die endgültige Kollagenlösung (5 ml) so schnell wie möglich. Gut mischen (durch Pipettieren oben und unten), während Luftblasen zu vermeiden, und dann verteilen schnell 200 ul der ready-to-use-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. schlagen Sie vorsichtig die Multi-Well-Platte auf der Arbeitsfläche Oberfläche der Zellkultur Haube Luftblasen zu entfernen und die Lösung gleichmäßig in den Vertiefungen zu verbreiten.
- Nach dem Befüllen alle Vertiefungen (dieser Schritt dauert etwa 15-20 Minuten pro 96-Well-Platte), bewahren Sie sie in den Inkubator.
- Die Platte bei 37 ° C von 2 h bis über Nacht. Collagen Gelierung (dh Fibrillogenese) tritt innerhalb von 30 min. Hinzufügen Kulturmedium (100 & mgr; l / Vertiefung) zu der Kultur einer Inkubation über Nacht durchzuführen.
2. Erste Schicht von Fibringelstruktur
- Fibrinogenlösung Vorbereitung.
HINWEIS: Die gleiche Charge von Fibrin-Gel sollte idealerweise für reproduzierbarer Resul verwendet werdents, wie Fibrin-Gel-Bildung zwischen verschiedenen Chargen von kommerziellen gefriergetrocknetem Fibrinogen kann variieren.- Verwenden Sie immer eine frisch zubereitete Fibrinogen-Lösung. Bringen Sie die gefriergetrockneten Fibrinogen auf Raumtemperatur vor dem Öffnen der Flasche Hydrat eine Kristallbildung zu vermeiden.
- Progressiv das Fibrinogen in vorgewärmten (37 ° C) Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) auflösen mit Ca 2+ / Mg 2+ bei einer Arbeitskonzentration von 3 mg / ml (erwägen , einen 15% Überschuß des Mindest Endvolumen erforderliche Vorbereitung : zB 17.25 mg in 5,75 ml einer 5 ml - Lösung).
- In vorgewärmten HBSS tropfenweise auf den ersten Fibrinogenfragmenten löslich zu machen. Break down größere Fragmente mit einem Spatel in den Becher. Agitieren den Becher von Zeit zu Zeit das Mischen zu erleichtern. Verwenden Sie keine Rührerplatte während des Verfahrens verwendet werden. Man löst das verbleibende Pulver durch Pipettieren der Suspension auf und ab.
- Halten Sie die Fibrinogenlösung lauwarm während steriLIZING die Lösung, indem sie durch ein 0,22 um-Filter geleitet. Hinweis: Wenn die HBSS nicht warm genug ist oder das Fibrinogen nicht vollständig gelöst ist, kann die Lösung den Filter verstopfen. Setzen Sie gegebenenfalls Filter ein- oder zweimal, was die Fibrinogenkonzentration verringern kann und damit Fibringerinnsels Steifigkeit.
- Suspend die Zellen von Interesse (zB Endothelzellen) in ready-to-use Fibrinogen - Lösung , während seine endgültige Einstellen der Lautstärke, als alternatives Verfahren.
- Vorbereiten der Thrombin-Lösungen.
- Bereiten Sie eine Stammlösung in ddH 2 O (50 NIH - Einheiten / ml), dann sterilisieren es einen 0,22 & mgr; m - Filter.
- Verwenden Sie ein Fibrinogen / Thrombin-Verhältnis ≥1: 0,0075 (v / v), um das Fibrin-Gel zu erzeugen.
- Die Erzeugung des Fibringelstruktur.
- Halten Sie das sterile Fibrinogen und Thrombin-Stammlösungen auf Eis während all den nächsten Schritten. Die Fibringele können in Platten mit 24 Vertiefungen zu bilden.
- Unverzüglich Overlay the Oberfläche jeder Vertiefung mit der Fibrinogen-Lösung (200 & mgr; l / Well) während der Luftblasenbildung zu vermeiden. Verfahren 6 Vertiefungen zu einer Zeit.
- Sobald vollständig die Fibrinogenlösung, die Oberfläche der Vertiefungen bedeckt, in einem 45 ° -Winkel der Platte kippen und 1,5 ul Thrombinlösung in die erste Vertiefung mit Hilfe des Thrombins in der Mitte des Bohrlochs fallen und dann auf die Platte leicht geschwenkt horizontal 1-2 sec.
- Lassen Sie die Platte in einer stabilen Position unter der Laminar - Flow - Haube (5-10 min) , bis die Gelierung / Gerinnungsprozess abgeschlossen ist (NB: Polymerisation darf nicht gestört werden, zum Beispiel indem man die Platte in den Inkubator zu transportieren).
- Sobald die ersten sechs Bohrungen polymerisiert haben, wiederholen Sie die gleiche Sequenz (dh die drei vorhergehenden Schritte) für die nächsten sechs Brunnen , bis alle Vertiefungen verarbeitet wurden.
3. Zweite Schicht von Fibringelstruktur und Sandwiched Collagen Stecker
- OptionA: (Mit Hilfe des Collagen-Plug sofort).
- Stellen Sie sicher, dass die erste Schicht aus Fibrin-Gel in allen Vertiefungen zart polymerisiert wurde von der Platte zu kippen. Legen Sie die 96-Well-Platte das Kollagen Gelpfropfen Seite an Seite mit der 24-Well-Platte (mit den Fibringelen), die Übertragung der Kollagen-Stecker zu erleichtern.
- Geben Sie einen Tropfen HBSS in jede Vertiefung der Platte, die die Kollagen-Stecker enthalten.
- Entfernen Sie jede Kollagen Stecker aus dem Bohrloch mit einer dünnen Nadel an einer Spritze befestigt (als Griff verwendet wird) oder mit einem Mikro-Löffel (siehe Video). Bringen Sie jede Kollagen-Stecker auf die erste Fibringelstruktur Schicht mit einem oder zwei Mikrolöffel, gleichzeitig aber dafür sorgen, dass das Kollagen Stecker gut in das Bohrloch zentriert ist und dass die Sterilität ist sehr gepflegt.
- Überlagern, die zuvor gebildete Fibrin-Gel mit der zweiten Schicht von Fibrinogen-Lösung (300 ul / Vertiefung) und die Einführung des Thrombins wie in 2.3 beschrieben, wird ein minimal 1 zu halten. 0,0075 Verhältnis und eine Sequenz von sechs Vertiefungen in einer Zeit </ Li>
- Option B (Beschichtung der Collagen-Stecker mit einer dünnen Schicht von Wachstumsfaktor-reduziert Basalmembran (GFRBM)).
- Kühle alle hergestellten Lösungen und Instrumente vorher und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis (zB Pipetten, Spitzen, Reagenzgläser) während seit gefrorenen Aliquoten GFRBM Handhabung sind sehr empfindlich gegen zu hohe Erwärmungsrate während des Auftauens (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers) .
- Nach der Entfernung von den Plattenvertiefungen, tränken jedes Kollagen Stecker für 2 Minuten in einer 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis, die 100 & mgr; l einer reinen GRFBM Lösung.
- Übertragen jeder beschichteten Stecker auf die erste Fibrinschicht, während es gewährleistet ist gut zentriert ist, wie oben beschrieben. Inkubieren der Steck enthaltenden Platten bei 37 ° C für 5 min die GRFBM zu ermöglichen, ein Gel zu bilden. Fügen Sie die zweite Fibrinschicht, wie in Schritt 3.1.4.
4. Zellkulturmedium Bedingungen
- Füllen Sie jede Vertiefung mit Kulturmedium (400 ul). Die Kulturmedien und Ergänzungen werden auf der Grundlage der Zelllinie und Versuchsbedingungen gewählt werden.
- Hinzufügen Aprotinin, ein Antifibrinolytikum, um Kulturmedium in einer Endkonzentration von 100 Kallikrein-Inhibitor-Einheiten (KIE) / ml.
HINWEIS: Bewahren Sie die Platten in einer Zellkultur-Inkubator unter den Bedingungen für die Zelllinie getestet verwendet. - Füllt Kulturen mit frischem Medium jeden zweiten Tag oder nach dem Versuchsplan, und fügen Sie Aprotinin. Vor Zugabe von frischem Medium, kippen leicht die Platte (bei 30-35 ° Winkel) und neigen die Pipette gegen die Seite des Bohrlochs während sorgfältig das konditionierte Medium unter ständiger Beobachtung Absaugen.
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Representative Results
Wie bereits erwähnt, ist ein interessantes Merkmal dieser 3D - Zellkulturassay , daß Krebszellen nicht nur aus dem Kollagenstopfen zum benachbarten Fibringel wandern kann, sondern auch sekundäre Tumoren (beispielsweise Satelliten - tumorartige Strukturen) herzustellen. Diese können direkt mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop bei niedrigen und hohen Vergrßerungen durch das Gel Dicke beobachtet, insbesondere mit einem großen Arbeitsabstand Kondensor (Abbildung 2). Unter Verwendung dieser 3D - Zellkulturverfahren kann das Verhalten von bekannten metastatischen Zellen ohne weiteres , daß in nicht-metastatischen Zellen verglichen werden, da 15 wiederholt mit verschiedenen Versuchsanordnungen gezeigt. Zum Beispiel sind zahlreiche Satelliten Tumoren in dem Fibrin - Gel mit der metastasierenden Zellinie B16F10 zufällig dispergiert , während nur sehr wenige winzige Satelliten Tumoren kann so mit seinem nicht-metastatischen Gegenstück erkannt werden, B16F0 - Zelllinie (2).
Fig . 2: Verhalten der Maus Melanoma B16F10 (A) und B16F0 (B) Zellen in der 3D - Zellkultur - System Die B16F10 und B16F0 Zellinien sind bekannt metastatic metastatic und schwach zu sein, respectively. Eine obere Ansicht des Verbund Gel wird nach 15 Tagen in Kultur in 24-Well-Platte gezeigt. Die Kollagenstopfens (*) ist auf eine Fibrin-Gel Schicht benachbart in dem Zellen gewandert sind (Pfeile) und gebildet Satelliten Tumoren wie bei höherer Vergrößerung gesehen. Ganz bequem, diese Zelllinien exprimieren ein hohes Maß an Melanin , das für die direkte Visualisierung erlaubt (dh ohne Färbung). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Form der Migrationsfront und Satelliten-Tumoren kann als func variierention der Zelllinie Eigenschaften. Zum Beispiel, die murine Brustdrüsenkarzinom 4T07 Zellen , die metastatischen schlecht sind , sind aber sehr invasive lokal, bilden eine Migrationsfront, die sich radial in das Fibrin - Gel (3A) erstreckt. Ähnlichen Brustdrüsenstrukturen (3B-D) Nach 14 Tagen Kultur wurden die Zellen gezogen von der wandernden Front entfernt Strukturen Sternform eng zu bilden.
Abbildung 3: Maus Brustdrüse Karzinom 4T07 Zellen. Diese Zellen zeigen eine starke Fähigkeit in der Fibrin - Gel (A) zu migrieren. Die gestrichelte Linie umreißt die Kollagen-Stecker und die Pfeile zeigen die Richtung der Migrationsfront. Die Zellen gleichmäßig die Fibrin - Matrix (A) eindringen, und gut organisiert, Sternform röhrenförmige Strukturen können in 3D (B ein beobachtet werdend C). Ansichten unter Phasenkontrastmikroskopie. (A - C) und histologischen Schnitten durch Hämatoxylin und Eosin (D) gefärbt werden angezeigt Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Zellstrukturen mit diesem 3D - Kultursystem beobachtet, insbesondere die Satelliten Tumoren, kann mit einer Methylenblau - Lösung nach dem Färben der Gele durch ebene Projektion quantifiziert werden , wie zuvor 16 gezeigt. Anfärben Gelproben mit Hoechst 33258 in verschiedenen Stadien der Zellkultur können die Zellkerne unter Epifluoreszenz Mikroskopie invertiert (Abbildung 4) sichtbar zu machen.
Abbildung 4: Hormon-Responsive Brustkrebszellen. Menschliche BrustCancer MCF-7 - Zellen wurden Exposed auf verschiedene Konzentrationen von Tamoxifen. Satelliten - Tumoren in Fibringelen (obere Reihe) durch Phasenkontrastmikroskopie beobachtet wurden. DNA aus den Kollagengelen (was die Anwesenheit von Zellen in pseudo-primären Tumoren) (untere Reihe) wurde gefärbt mit Hoechst 33258 und visualisiert Epifluoreszenzmikroskopie verwendet. Wie zu erwarten, als Folge der Apoptose induzierten DNA - Fragmentierung Tamoxifen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Reagenzien | Volumen |
| DMEM 5x (kein Bicarbonat) aus Pulver vorbereiten | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCO 3 | 0,5 ml |
| 1 N NaOH | 20 ul |
| ddH2O | 100 ul |
| Diese Lösung wird auf Eis | |
| Die Zellsuspension | 880 & mgr; l |
| Nun mischen auf Eis und schließlich schnell hinzu: | |
| RTT Collagen (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| Volle Lautstärke | 5 ml |
Tabelle 1:. Collagen Plugs Erforderliche Reagenzien und Herstellung einer Kollagenlösung für 18-19 Topfen. Gut mischen unmittelbar nach der Zugabe des Kollagens (durch den Behälter nach oben Umkehren und unten), während Luftblasen zu vermeiden, und dann verteilen umgehend 200 ul in jede Vertiefung.
| Schritte | | Mögliche Gründe | Lösungen | |
| Schritt 1. Collagen Stecker | Luftblasen | Unangemessen Pipettieren * | Gut mischen, während übermäßige Blasen zu vermeiden. |
| Zeichnen Sie die jeweils 200 & mgr; l mit Pipettenkolben ganz nach unten und lassen Sie nur 200 & mgr; l (reverse Pipettieren). * | |||
| Collagen Stecker Kontraktion | Collagen Stecker schrumpft mit bestimmten Zelllinien, insbesondere dann, wenn über Nacht inkubiert. | Überprüfen Sie, ob Zellen Kollagen Kontraktion induzieren vor Versuchsbeginn. Es wird empfohlen, Kontraktion über ein paar Tage zu überwachen. Andernfalls kann Topfen in dem sandwichartig Gel kontrahieren. | |
| Gelierung tritt nicht auf, | Überprüfen Sie Reagenzien für Frische, Molarität, pH-Wert, etc.); stellen Sie sicher, kein Reagenz wurde verzichtet. | Beginnen Sie noch einmal von begInning. | |
| Schritt 2. Erste Schicht Fibringelstruktur | Luftblasen | Gleiche Kommentare *; brauchen Praxis. | Gleiche Lösung. * Luftblasen können in dem Fibrin-Gel bleiben, sondern sie in der Regel im Laufe der Zeit bei 37 ° C verschwindet. |
| Gelierung tritt nicht auf, | Falsche Menge von Fibrinogen verwendet wird; prüfen Thrombinkonzentration oder Abbau. | Beginnen Sie noch einmal von Anfang an. | |
| Angenommen, die Thrombin-Lösung ist unzureichend; leicht , die Konzentration erhöhen und / oder das Volumen des Thrombins (beispielsweise zweimal). | |||
| Restflüssigphase nach dem Gelieren | Fibrinogenlösung und Thrombin nicht gut gemischt. | Beginnen Sie noch einmal von Anfang an. | |
| Fibrin ist nicht homogen (dh Fibrillenstrukturen, Agglomerate) | Thrombin ist unzureichend in das Gel diffundiert; Exfolgende oder mangelnde Bewegung | Brauchen Praxis; beginnen wieder von Anfang an. | |
| Schritt 3. Sandwich / 2 nd Fibrinschicht | Gleiche Kommentare wie in Schritt 2. | ||
| Collagen Stecker ist schnell (einige Stunden) durch leere Bereiche in Fibrin umgeben | Fibrin wurde nicht ausreichend in Kontakt mit Kollagengel polymerisierenden | Beginnen Sie noch einmal von Anfang an | |
| Collagen-Stecker (Tage-Wochen) werden von leeren Flächen umgeben kann schrittweise in Fibrin | Lokale Lyse; | Wenn es an einigen Stellen rund um den Stecker beschränkt ist, kann das Experiment weitergehen. Andernfalls bitte von Anfang an zu beginnen. Könnte an Zellen sezer übermäßige Menge an Plasminogen-Aktivator fällig. | |
| Vergessen Sie nicht die Antifibrinolytikum! | |||
| Schritt 4 und 5. Cell Kultur und Follow-up | Fibrinolyse | Problem mit dem Antifibrinolytikum (Abbau, suboptimale Dosis usw.). | Wenn umfangreiche Menge an Satelliten Tumoren oder Invasion, erhöhen Sie die Dosis von Antifibrinolytikum. |
| Versauerung | Übermäßige Zellwachstum. | Ändern Zellkulturmedium häufiger. | |
Tabelle 2: Fehlerbehebung Mögliche Probleme und Lösungen vorgeschlagen werden ..
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Discussion
Als wichtige technische Fußnote ist es wesentlich, dass kein Spalt an der Grenzfläche zwischen dem zentralen vorhanden ist, und die peripheren Gelen. Andernfalls könnte es die Fähigkeit der Zellen zu reduzieren, um das Fibrin-Gel wandern / eindringen. Ein Raum zwischen dem Kollagen und Fibrin-Gelen kann während der ersten 24 Stunden der Kultur bilden, wenn Thrombin wurde nicht in geeigneter Weise verdünnt worden ist. Es ist auch möglich, dass die Zelllinie in Kultur getestet könnte das Kollagengel führen, zu kontrahieren, wodurch ein relativ großer Raum zwischen den beiden verursacht Gele zu bilden. Dies ist besonders dann zu erwarten , wenn Stromazellen in dem Kollagengel gemischt werden zusammen mit Krebszellen aufgrund myofibroblastischer-ähnliche Aktivität 18. Um dieses Artefakt zu vermeiden, wird die Kollagen Stecker sollte für einen längeren Zeitraum (≥48 h bei 37 ° C inkubiert werden , ) Gelkontraktion vor dem Zusammenbau des Fibrin-Sandwich zu induzieren.
Ein Problem mit dem Assay auftritt, ist die Anwesenheiterkennbarer Fibrin Fibrillen oder Agglomerate. Dies verleiht eine wolkige statt scheinend Aspekt der Fibrin-Gel, was durch die Störung der Krebszellmigrationswege Dateninterpretations erschwert. Solche Probleme durch unzureichende oder übermäßige Schütteln der Fibrinogen-Lösung während des Polymerisationsverfahrens in den Kulturplatten entstehen können. Es kann auch auf die falsche Zugabe von Thrombin in die Fibrinogenlösung (Schritt 2.3) fällig. Ein unförmig oder trübe Fibrin-Gel kann nicht einmal verfestigt fixiert werden. Collagen oder Fibrin-Gele können Luftblasen, die in den meisten Fällen werden spontan befreit heraus nach einigen Tagen im Inkubator enthalten; dennoch pipettieren minimiert ihr Auftreten. Es wird empfohlen, ein anti-fibrinolytisches Mittel zu Beginn der Zellkulturperiode einzuführen. Fibrinolyse kann nach einer langen Zeit der Zellkultur aufgrund der Zellaktivität und die Aktivierung von proteolytischen Enzymen (dh Plasminogenaktivator) innerhalb der c auftreten ,ollagen Stecker und die Satelliten Tumoren in Abhängigkeit von den Krebszelltypen und ihre Aggressivität 19 .Die Freisetzung des Kollagens Stecker aus dem verschlechterten Fibringelstruktur und Zellbindung an der Unterseite der Platten sind zwei Folgen von übermäßigem Fibrinolyse (Abschnitt zur Fehlerbehebung in der Tabelle zu sehen 2). Eine Einschränkung der vorliegenden Technik ist die Dicke des Fibrin-Gel, die es schwierig machen können Zellen durch den gesamten Gels zu beobachten. Jedoch hilft die Verwendung eines Mikroskops mit einem langen Arbeitsabstand Kondensor diese Einschränkung zu umgehen, und die Zellen entlang der gesamten Z-Achse zu überwachen. Konfokalen oder Intravitalmikroskopie kann auch eine Alternative, die Zellen in dem Fibrin-Gel sichtbar zu machen.
Eines der wichtigsten Ziele für diese Zellkulturmodell 3D-Entwicklung war eine extrazelluläre Matrix Raum, durch die Krebszellen in der Lage sind, zur Verfügung zu stellen, um frei zu migrieren und zu entwickeln. Fibrin wurde aufgrund seiner Anwesenheit in Tumoren ausgewählt ist,die verdankt die durch eine Entzündung, Nekrose und veränderte Angiogenese, und da Fibrin ist auch bekannt induzierten vaskulären Permeabilität zur Erhöhung der Tumorzellinvasion 20,21 zu erleichtern. Die Schnittstelle zwischen den zwei Fächern zeigt viel Interesse, da sie die Herstellung neuer Trägermatrix, wie beispielsweise Fibrin, in Tumoren nachahmt. Außerdem Sauerstoff und Nährstoffdiffusion und auf längere Sicht, pH-Stabilität, sind möglicherweise in der Kollagenfach gegenüber dem peripheren Fibrin Kompartiment dysreguliert in denen Diffusions erleichtert wird. Aufgrund der großen Zahl von Krebszellen zunächst in einem zentralen Kollagenpfropfen aggregiert, Anzeichen von Nekrose / Apoptose innerhalb des Primärtumors während der Kultur beobachtet, die 22 während der Expansion von primären Tumoren in Patienten beobachtet Phänomen zu simulieren. Außerdem wird die Bildung von Satelliten-Tumoren bemerkenswert zu der Aggressivität von Krebszellen im Zusammenhang sowie deren metastatische Verhalten. Je nach Zelllinie und Art of Versuch, die Zeit der Inkubation erforderlich für relevante metastasierendem Prozesse zu beachten, kann so lange wie 30 Tage. Dies ist in der Regel länger als bei anderen 3D - Assays, aber die zusätzliche Verzögerung bringt den Vorteil , ein Modell repräsentativer für in situ Tumoren untersuchen.
Es ist allgemein anerkannt , dass in 3D Kulturmodellen zeigen Unterschiede in der Zellsignalisierung und die Genexpression im Vergleich zu einschichtigen Zellkulturen 5,23 gewachsenen Zellen. Wachsende Krebszellen in 3D wirkt sich auch auf ihre Empfindlichkeit gegenüber chemotherapeutischen Mitteln 24-26. Ein wichtiges und attraktives Merkmal dieser 3D-Zellkulturmodell besteht in der Möglichkeit, die ECM-Konzentration zu verändern, und somit die Steifigkeit des Gels, die von Interesse sind diejenigen, können auf den biomechanischen Eigenschaften der Zell-Zell und Zell-ECM Arbeits Wechselwirkungen sowie die Wirkung der Matrixeigenschaften auf Zellinvasion / Migrationsprozesse 27. Die 3D-Zellkulturtest hier präsentiert werden können anpassened unterschiedlichen Einstellungen und / oder Versuchsbedingungen. Beispielsweise kann der Assay skaliert werden Studien zur Aufnahme einer großen Anzahl von Zellen erforderlich ist; durch die Menge an Material zu verdoppeln und die Anzahl der Zellen, Kollagenstöpsel kann in einer 48-Well-Platte und geschichtet auf eine Fibrin-Gel in einer 6-Well-Platte hergestellt werden. Auf der anderen Seite kann es schwierig sein, das Kultursystem für Hochdurchsatz-Studien und Messungen aufgrund von inkonsistenten Homogenität des Fibrin-Gel zu miniaturisieren.
Die Einführung von Nicht-Krebszellen in einer der beiden Kammern Gel kann das Verhalten der Krebszellen zu modifizieren. Beispielsweise wird die Bildung von Satelliten Tumoren verschlimmert , wenn die PC3 Prostata - Krebszelllinie mit Fibroblasten und Endothelzellen gemischt wird 14. Alternativ können fluoreszenzmarkierten Zelllinien im Gel Abteile eingeführt werden Zell-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen und / oder die Zellen während der Kulturperiode zu verfolgen. Außerdem hallostological Abschnitte können nach Gel Fixierung hergestellt werden; Allerdings unterscheiden sich die Qualität der immunhistochemischen Ergebnisse können zwischen Antikörpern, da Kreuzreaktionen mit Fibrin auftreten. Routine - Färbung histologischer Schnitte wie mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) kann in der Gel - Matrizes (Abbildung 3D) offenbaren Zellorganisation.
Es ist relativ einfach , den Kollagenstopfen aus dem Fibrin - Gel zu entfernen (beispielsweise durch den Stopfen mit einer Glaspipette Herausziehen). Somit können Zellen vorhanden und Satelliten Tumoren im Fibrin-Gel getrennt von denjenigen in der Kollagenpfropfen gefunden werden gezüchtet. Zellen aus den Satelliten-Kolonien können durch Extrahieren der Kolonien mit chirurgischen Schere oder einem Skalpell und wächst sie in Kulturmedium geerntet werden, ohne den freien Zellen aus dem Fibrin-Gel Aprotinin. Sammeln Zellen aus den verschiedenen Abteilungen des Verbund Gel kann verschiedene weitere Studien ermöglichen, einschließlich Gen- und Proteinexpressionsanalyse. Es kannauch Zellpopulationen mit aggressiven Phänotypen zu isolieren für weitere in - vitro- oder in - vivo - Studien verwendet werden. Zum Beispiel wurde das 3D - Kulturmodell Gene verwendet in Melanom - Metastasen 16 beteiligt zu identifizieren. All diese repräsentativen Anwendungen zeigen deutlich die erlaubt Flexibilität durch eine bi-Kompartment-3D-Zellkultursystem, in dem Zell Kokultur durchgeführt werden kann.
Im Ergebnis ist das Design unserer 3D-Kultursystem flexibel und neue Wege der biologischen und molekularen Vorgänge während der Krebszellen Apoptose, Migration und Metastasierung zu untersuchen und für Anti-Krebs-Medikament Auswertung bieten kann.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
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