Krebszellen werden in ein Kollagengel eingebettet und dann in ein azelluläres Fibringel eingebettet, um ein 3D-Kultursystem zu erzeugen, in dem die Invasivität und Bildung von Satellitentumoren überwacht werden kann.
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Methodenartikel
Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Säugerzellkultur in Monolayern wird weithin verwendet, um verschiedene physiologische und molekulare Prozesse zu untersuchen. dieser Ansatz jedoch zu wachsenden Zellen studieren erzeugt oft unerwünschte Artefakte. Daher Zellkultur in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung, die oft extrazelluläre Matrixkomponenten verwenden, erwies sich als eine interessante Alternative wegen seiner Ähnlichkeit mit dem nativen in vivo Gewebe oder Organ. Wir entwickelten ein Kultursystem 3D - Zelle zwei Abteilen unter Verwendung, nämlich (i) eine zentrale Kammer Krebszellen enthält , in einem Kollagengel wirkenden eingebettet als pseudo-primäre macrospherical Tumors und (ii) einem peripheren zellfreien Kammer aus einem Fibrin - Gel, dh eine extrazelluläre Matrixkomponente , die sich von der in der Mitte verwendet werden, in denen Krebszellen (invasion vorne) wandern und / oder mikrosphärischen Tumoren bilden darstellt sekundäre oder Satelliten Tumoren. Die Bildung von Satelliten-Tumoren im peripheres Kompartiment istbemerkenswert korreliert mit der bekannten Aggressivität oder metastasiertem Ursprung der nativen Tumorzellen, die diese 3D-Kultursystem einzigartig macht. Dieser Zellkulturansatz könnte als Krebszelle Invasivität und Motilität, Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen und als ein Verfahren zur Beurteilung anti-Krebs-Medikament Eigenschaften zu bewerten.
Einleitung
Die grundlegenden und biomedizinischen Eigenschaften der Invasion von Krebszellen / Migration und anschließende Metastasierung Einrichtung zu untersuchen , ist Gegenstand einer intensiven Forschung 1,2. Metastasierung ist die letzte Stufe der Krebs und seine klinische Management bleibt schwer zu fassen. Ein besseres Verständnis der Metastasierung auf zellulärer und molekularer Ebene wird die Entwicklung effizienterer Therapien 3 ermöglichen.
Mehrere Eigenschaften von metastatischen Zellen können in vitro 4 einschließlich ihrer stemness und potentielle einen Übergangszustand (beispielsweise
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Protokoll
HINWEIS: Keine Ethik Betracht, da tierische und menschliche Krebszellen erworben wurden oder uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt.
1. Erstellen Collagen Stecker (Pseudo-Primärtumor)
- Bereiten Sie eine Kollagen-Dispersion. Typ I aus Rattenschwanzsehnen (RTT) Kollagen kann entweder extrahiert und sterilisiert werden , wie zuvor 17 berichtet, oder gekauft haben . Disperse gefriergetrocknet RTT Kollagen (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N Essigsäure) mit einem Mixer (High-Speed-Einstellung, fünf 2 min läuft) für eine gleichmäßige Durchmischung.
- Harvest (Trypsin-EDTA, in der Regel) und verwenden Trypanblau-Ausschluss für das Zählen ....
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Ergebnisse
Wie bereits erwähnt, ist ein interessantes Merkmal dieser 3D - Zellkulturassay , daß Krebszellen nicht nur aus dem Kollagenstopfen zum benachbarten Fibringel wandern kann, sondern auch sekundäre Tumoren (beispielsweise Satelliten - tumorartige Strukturen) herzustellen. Diese können direkt mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop bei niedrigen und hohen Vergrßerungen durch das Gel Dicke beobachtet, insbesondere mit einem großen Arbeitsabstand Kondensor (Abbildung 2).......
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Diskussion
Als wichtige technische Fußnote ist es wesentlich, dass kein Spalt an der Grenzfläche zwischen dem zentralen vorhanden ist, und die peripheren Gelen. Andernfalls könnte es die Fähigkeit der Zellen zu reduzieren, um das Fibrin-Gel wandern / eindringen. Ein Raum zwischen dem Kollagen und Fibrin-Gelen kann während der ersten 24 Stunden der Kultur bilden, wenn Thrombin wurde nicht in geeigneter Weise verdünnt worden ist. Es ist auch möglich, dass die Zelllinie in Kultur getestet könnte das Kollagengel führen, zu kontrahiere.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Offenlegung.
Danksagungen
Die Arbeit wurde teilweise von Prostate Cancer Canada (Zuschuss # D2014-4 an SG und CJD) und den Canadian Institutes of Health Research (Zuschuss # MOP-111069 an SG) finanziert. Wir danken Dr. Richard Poulin für die redaktionelle Unterstützung und Frau Chanel Dupont für die technische Unterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gefriergetrocknetes Kollagen | Sigma-Aldrich | C7661 | aus Rattenschwanzsehne (lösliche Dispersion) oder selbst hergestellt (siehe Rajan et al., Ref.#14) |
| Fibrinogen (gefriergetrocknet) | Sigma-Aldbsp; | F8630 | Typ I-S, 65 - 85 % Protein mit > 75 % Protein ist gerinnbar |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH-Einheiten/mg Trockengewicht |
| Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel | Corning | 356234 | Zuvor von BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | Lösung bei 5 - 10 T I.E./ml (Trypsin-Inhibitor-Einheit) |
| Mikrolöffel | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 Well Platte, runder Boden | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 Well Platte | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modifizierte Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fötales Rinderserum | VWR | CAA15-701 | FBS, kanadischer Ursprung. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. KG | T4049 | |
| Hank' s Ausgewogene Salzlösung | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
Referenzen
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori....
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Nachdrucke und Genehmigungen
