Microfluidique Buffer Exchange pour sans interférence Micro / Nanoparticules ingénierie cellulaire
Summary
Ce protocole décrit l'utilisation d'une stratégie d'échange de tampon inertielle à base microfluidique pour purifier les cellules modifiées micro / nanoparticules avec l'épuisement efficace des particules non liées.
Abstract
cellules d'ingénierie avec micro ingrédient actif chargé / nanoparticules (IP) devient une méthode de plus en plus populaire pour améliorer les propriétés thérapeutiques indigènes, activer bio imagerie et contrôler le phénotype cellulaire. Une question cruciale encore insuffisamment abordée est le nombre important de particules qui restent non liés après marquage des cellules qui ne peuvent pas être facilement éliminé par centrifugation classique. Cela conduit à une augmentation de la bio bruit imagerie de fond et peut donner des effets transformateurs sur des cellules non-cibles voisines. Dans ce protocole, nous présentons un tampon stratégie d'échange inertiel à base microfluidique appelé comme Dean flux Fractionnement (DFF) pour séparer efficacement les cellules marquées de NPs libres d'une manière à haut débit. Le microdispositif spirale développé facilite la collecte continue (> de récupération des cellules de 90%) des cellules purifiées (THP-1 et CSM) en suspension dans une nouvelle solution tampon, tout en atteignant> 95% épuisement de colorant fluorescent non lié ou NPs colorant chargé (silique ou PLGA). Cette seule étape, la stratégie de purification de cellules basée sur la taille permet de haute cellule de traitement débit (10 6 cellules / min) et est très utile pour un grand volume de purification de cellules de micro cellules / nanoparticulaires conçue pour parvenir à une application clinique sans interférence.
Introduction
Ingénierie des cellules par l' agent chargé des micro / nanoparticules (NP) est une méthode sans intégration, et polyvalent simple, génomique pour améliorer la capacité de bioimagerie et d' augmenter / compléter ses propriétés thérapeutiques indigènes en médecine régénérative. 1-3 modifications cellulaires sont atteints par l' étiquetage de la membrane plasmique ou le cytoplasme avec une concentration supérieure à NPs __gVirt_NP_NN_NNPS<__ agents chargés pour saturer les sites de liaison. Cependant, un inconvénient majeur de cette méthode est que les quantités importantes de particules libres restant en solution après les processus d'étiquetage des cellules, ce qui peut potentiellement confondre l' identification précise des cellules de particules-ingénierie ou compliquer les résultats thérapeutiques. 4,5 En outre, l' exposition aux NPs contenant transformatrice agents (facteurs de croissance, corticoïdes, etc.) à trop forte concentration peut causer la cytotoxicité et l' exposition mal dirigée peut induire des conséquences inattendues sur les cellules non-cibles. Même comprenant des supports particulaires of matériaux "biocompatibles" [par exemple, le poly (acide co-glycolique), PLGA] peuvent inciter les réponses des cellules immunitaires puissantes dans certaines conditions ainsi. 6 Ceci est particulièrement risquée chez les personnes souffrant d'une déficience de l' immunité (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde) qui potentiellement retards clairance systémique de nanoparticules. 7 Ainsi, une élimination efficace des particules libres avant l'introduction de cellules de particules conçu est d' une grande importance pour réduire au minimum le profil de toxicité et de réduire l' exposition mal acheminés aux particules d'agent chargé in vivo.
Classique centrifugation à gradient est souvent utilisée pour séparer les cellules modifiées à partir de particules libres, mais est laborieux et exploité en mode par lots. En outre, les contraintes de cisaillement subies par les cellules lors de centrifugation à grande vitesse et les constituants du milieu de gradient de densité peut compromettre l' intégrité des cellules et / ou le comportement des cellules influence. 8 microfluidique est une alternative intéressante avec sevles technologies de séparation , y compris plu- déplacement latéral déterministe (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 et acoustophorèse 12 développé pour les petites particules de séparation et les applications d'échange de tampon. Cependant, ces méthodes souffrent d' une faible débit (1-10 pi · min – 1) , et sont sujettes à des problèmes de colmatage. séparations actives telles que les méthodes basées sur diélectrophorèse nécessitent également des différences dans les phénotypes cellulaires diélectrophorétique intrinsèques ou des étapes de marquage des cellules supplémentaires pour atteindre la séparation. Une approche plus prometteuse consiste à microfluidique inertielle – la migration latérale des particules ou des cellules à travers rationalise de se concentrer sur des positions distinctes en raison de forces de portance dominantes (F L) à haute nombre de Reynolds (Re) 13 En raison de ses conditions d'écoulement élevées et la résolution de taille supérieure. , il a souvent été exploitée pour des applications d'échange basés sur la taille de séparation des cellules 14,15 et tampon. 16-18 However, la performance d'échange de tampon reste pauvre avec une solution contaminant ~10-30% comme les cellules séparées restent généralement à proximité de la frontière entre des solutions originales et de nouveaux tampons. 16-18 Plus important encore , la distribution de taille des cellules cibles doit être similaire pour atteindre inertielle mise au point précise et la séparation de la solution tampon initiale qui pose un problème particulier dans le traitement des types de cellules hétérogènes telles que la taille des cellules souches mésenchymateuses (CSM). 19
Nous avons déjà mis au point une nouvelle technique cellule microfluidique inertielle de tri appelé Dean flux Fractionnement (DFF) pour isoler les cellules tumorales circulantes (CTC) 20 et les bactéries 21 du sang entier en utilisant un 2-entrée, dispositif de microcanaux spirale 2-sortie. Dans ce protocole vidéo, nous allons décrire le processus de cellules d'étiquetage THP-1 (lignée humaine de cellules de leucémie monocytaire aiguë) suspension monocytes (~ 15 um) et MSCs (10-30 um) avec calcéine-lNPs oaded, suivie par la fabrication et le fonctionnement du microdispositif en spirale FFD pour la récupération efficace des cellules marquées et l' élimination des IP non liées. 22 Cette stratégie unique de purification de l' étape permet la récupération en continu de suspension marqué et les cellules adhérentes en suspension dans une solution tampon frais sans centrifugation. En outre, il peut traiter jusqu'à 10 millions de cellules · ml -1, une densité de cellules qui se prêtent à des applications en médecine régénérative.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technologie de purification des cellules DFF décrit ici permet une séparation rapide et continue de cellules marquées d'une manière à haut débit. Cette approche de séparation est idéale pour un grand volume d'échantillon élevé ou le traitement des échantillons de concentration cellulaire, et est meilleure que la filtration à membrane à base conventionnelle qui est sujette à l'encrassement, après une utilisation prolongée. De même, la séparation magnétique basée sur l'affinité né…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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