간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환
Summary
이 프로토콜은 언 바운드 입자의 효율적인 고갈과 마이크로 / 나노 입자 설계 세포를 정화하는 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략의 사용을 설명합니다.
Abstract
활성 성분 로딩 마이크로 / 나노 입자 공학 세포 (NPS는) 고유 치료 특성을 향상 바이오 이미징 활성화 및 세포 표현형을 제어하기 점점 더 많이 사용되는 방법이되고있다. 중요한 아직 부적절하게 해결 문제는 쉽게 기존의 원심 분리로 제거 할 수없는 셀 라벨 후 언 바운드 남아있는 입자의 상당수입니다. 이 생체 촬상 배경 잡음의 증가를 초래하고 인접 비 표적 세포 상 변화시키는 효과를 부여 할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 효율적으로 높은 처리량 방식으로 무료 NP에에서 표지 세포를 분리 딘 흐름 분획 (DFF) 되나 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략을 제시한다. 결합되지 않은 형광 염료 또는 염료 로딩 된 NP (SIL의> 95 % 고갈을 달성하면서 개발 된 나선형 마이크로 디바이스는, 새로운 완충액에 현탁 정제 세포 (THP-1 및 중간 엽 줄기 세포)의 연속 컬렉션 (> 90 %의 세포 복구)을 용이ICA 또는 PLGA). 이 단일 단계 크기 기반 셀 정제 전략은 높은 셀 처리량 (106 세포 / 분)을 가능하게하며, 무 간섭 임상 적용을 달성하기 위해, 마이크로 / 나노 공학 세포의 대용량 전지의 정제에 매우 유용하다.
Introduction
에이전트로드 마이크로 / 나노 입자 NPS ()에 의해 세포를 엔지니어링하는 bioimaging 기능을 강화하고 재생 의학에 네이티브 치료 특성을 보충 / 보강하는 간단한, 게놈 통합이없는, 그리고 다양한 방법입니다. 1-3 세포 변형이 라벨에 의해 달성된다 에이전트로드 NP에 과량의 농도와 세포막이나 세포질은 결합 부위를 포화합니다. 그러나,이 방법의 주요 단점은 변형이 포함 된 NP에 상당한 잠재적으로 입자 조작 된 세포의 정확한 식별을 혼동 또는 치료 결과를 복잡하게. 4,5 또한 수 셀 라벨 처리 후 용액에 남아있는 언 바운드 입자의 양, 노출입니다 과도하게 높은 농도의 제 (성장 인자, 스테로이드 등) 비 표적 세포에 대한 의도하지 않은 결과를 유발할 수 잘못 전달 독성 및 노출을 야기 할 수있다. O를 포함하더라도 입자 캐리어f를 "생체 적합성"재료 [예를 들어, 폴리 (유산 공동 글리콜 산), PLGA]는 강력한 면역 세포의 특정 조건에서 반응뿐만 아니라 선동 할 수 있습니다. (6)이 손상된 면역 (예를 들어, 류마티스 관절염) 잠재적으로 지연을 가진 개인에서 특히 위험하다 전신 나노 틈새. (7) 따라서, 종래의 입자 공학 세포 도입 자유 입자의 효율적인 제거는 독성 프로파일을 최소화하고 생체 내에서 에이전트로드 입자 잘못 전달 노출을 줄이기 위해 매우 중요하다.
종래 구배 원심 분리는 종종 자유 입자로부터 설계된 세포를 분리하는 데 사용하지만 수고하고 배치 모드에서 작동된다. 또한, 고속 원심 동안 세포와 세포의 무결성 및 / 또는 영향 셀의 동작을 손상시킬 수있는 밀도 구배 매질의 성분에 의해 경험되는 전단 응력. 8은 미세 유체 SEV 매력적인 대안결정 론적 측면 변위 (DLD) 9, 10, 11을 dieletrophoresis 작은 입자의 분리 및 버퍼 교환 응용 프로그램 개발 (12) acoustophoresis 포함 대한 일반적인 분리 기술. 그러나 이러한 방법은 낮은 처리량 고통 (1-10 μL · 분 – 1) 문제를 막힘하는 경향이 있습니다. 이러한 유전 기반의 방법으로 활성 분리는 또한 고유의 유전 세포 표현형 또는 분리를 달성하기 위해 추가 셀 라벨 단계의 차이를 필요로한다. 에서 입자 또는 세포의 측면 이동을 때문에 높은 유동 조건과 우수한 크기의 해상도로 인해 높은 레이놀즈 수 (재) 13에서 지배적 인 리프트 힘 (F의 L)에 별개의 위치에 초점을 간소화 – 더 유망한 접근 방식은 관성 미세 유체를 포함한다. , 그것은 종종 크기 기반의 세포 분리 14, 15 및 버퍼 교환 애플리케이션에 이용되고있다. 16 ~ 18 Howeve분리 된 세포는 일반적으로 원본과 새로운 버퍼 용액과의 경계 부근에 남아있는 (R), 버퍼 교환 성능은 ~10-30 % 오염물 용액 여전히 좋지. 16-18 더 중요한 표적 세포의 크기 분포를 달성하기 위해 유사하게 보유 특히 중간 엽 줄기 세포와 같은 이종 크기의 세포 유형 (MSCS)의 처리에 문제를 제기 원래 완충 용액에서 정확한 초점을 맞추고 관성 및 분리. (19)
우리는 이전에 새로운 관성 미세 유체 세포 분류 기법은 2 유입구,이 출구 나선형 마이크로 채널 장치를 사용하여 순환 성 종양 세포 (CTCS) 전혈 20 세균 21 단리 딘 흐름 분획 (DFF)을 지칭 개발 하였다. 이 비디오 프로토콜에서는 라벨 THP-1 (인간 급성 단핵구 백혈병 세포주) 현탁 단핵 세포 (~ 15 μm의) 및 칼 세인 -1-와 중간 엽 줄기 세포 (10 ~ 30 μm의) 프로세스를 설명한다oaded NP에 표시된 세포와 결합되지 않은 NP에 제거의 효율적인 복구를위한 DFF 나선형 마이크로 디바이스의 제조 및 작동 하였다. (22)이 한 단계 정화 전략 레이블 서스펜션과 원심 분리하지 않고 신선한 완충 용액에 현탁 부착 세포의 연속 재생을 할 수 있습니다. 또한, 천만 세포 · 용액 -1, 셀 밀도 재생 의학의 응용에 대한 의무까지 처리 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기술 된 셀 DFF 정화 기술은 높은 처리량의 방식으로 표지 된 세포의 신속한 연속 분리 할 수있다. 이 분리 방법은 많은 샘플 량 또는 높은 세포 농도 시료 처리에 적합하고, 장시간 사용 후에 막히는 경향이 종래의 막 여과 계보다 낫다. 마찬가지로, 선호도 기반의 자기 분리가 힘들고 비용이 추가 셀 라벨 단계가 필요합니다. 정제 된 세포 (채널 내에 때문에 짧은 체류 시간에 자신의 레…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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