Parazit Mikro / Nanoparçacık Hücre Mühendisliği mikroakışkan Tampon Değişim
Summary
Bu protokol, bağlanmamış partiküllerin randımanlı bir şekilde azalması olan mikro / nanopartikül mühendislik hücrelerinin saflaştırılması için bir atalet Mikroakiskan tabanlı tampon değişimi stratejisi kullanımını tarif eder.
Abstract
Aktif-madde yüklü mikro / nano partiküller ile mühendislik hücreleri (NPS), yerli terapötik özellikleri geliştirmek biyo görüntüleme sağlamak ve hücre fenotipi kontrol etmek için giderek daha popüler bir yöntem haline geliyor. Kritik henüz yetersiz giderilen sorun kolayca geleneksel santrifüj kaldırılamaz hücre etiketleme sonra ilişkisiz kalır parçacıkların önemli bir sayıdır. Biyo görüntüleme plan gürültüsünde bir artışa yol açar ve komşu olmayan hedef hücreler üzerinde dönüştürücü etkisi kazandırabilir. Bu protokol, biz verimli bir yüksek verimli bir şekilde serbest NP etiketli hücreleri ayırmak için Dean Akış Fraksiyonu (DFF) olarak adlandırılan bir atalet Mikroakiskan tabanlı tampon değişimi stratejisi sunuyoruz. Bağlanmamış bir floresan boya veya boya yüklü NP (SIL>% 95 azalmasını elde ederken geliştirilmiş sarmal mikrovasıta, yeni bir tampon çözeltisi içinde süspansiyon haline saflaştınldı hücrelerinden (THP-1 ve MSC'ler) sürekli toplama (>% 90 hücre geri kazanım) kolaylaştırırica veya PLGA). Bu tek aşamalı, boyut tabanlı hücre arıtma stratejisi yüksek hücre işleme verimi (10 6 hücre / dak) sağlayan ve parazitsiz klinik uygulama sağlamak için mikro / nanoparçacık mühendislik hücrelerin büyük hacimli hücre arıtma için son derece yararlıdır.
Introduction
Ajan yüklü mikro / nano partiküller (NPS) hücreleri mühendislik bio yeteneği geliştirmek ve rejeneratif tıpta doğal tedavi edici özelliklere ek / artırmak için basit, genomik entegrasyon-free, ve çok yönlü bir yöntemdir. 1-3 Hücresel değişiklikler etiketleyerek elde edilir ajan yüklü NPS aşırı konsantrasyon ile plazma zarı ya da sitoplazma bağlayıcı siteleri doyurmak için. Bununla birlikte, bu yöntemin önemli bir sakıncası dönüştürücü ihtiva eden NP önemli potansiyel partikül işlenmiş hücrelerde tam kimlik bulandırabilir veya terapötik sonuçlar karmaşık hale getirmektedir. 4,5 Ayrıca hücre etiketleme işlemleri sonrası çözeltide kalan bağlanmamış parçacık miktarları, maruz olduğu aşırı derecede yüksek bir konsantrasyonda maddeler (büyüme faktörleri, kortikosteroidler, vs.) hedef olmayan hücreler üzerinde istenmeyen sonuçları indükleyebilir sitotoksisitesinin ve yanlış yönlendirilmiş riskini ortaya çıkarmaktadır. o içeren parçacıklı bir taşıyıcıf "biyolojik olarak uyumlu" malzemeler [örneğin, poli (laktik ko-glikolik asit), PLGA] güçlü bir bağışıklık hücresi, belirli koşullar altında yanıtlar da teşvik edebilir. 6 Bu bağışıklığı (örn, romatizmal artrit), potansiyel olarak gecikmeler olan kişilerde özellikle riskli sistemik nanopartikül izni. 7 Dolayısıyla, önceki parçacık işlenmiş hücrelerde giriş için serbest partiküllerin randımanlı bir şekilde çıkarılması toksisite profilini en aza indirmek ve in vivo madde yüklü parçacıklara yönlendirilmiş maruz kalmayı azaltmak için büyük bir önem taşımaktadır.
Konvansiyonel gradient santrifüj genellikle ücretsiz parçacıklardan mühendislik hücreleri ayırmak için kullanılan, ancak zahmetli ve toplu modunda çalıştırılır. Ayrıca, yüksek hızda santrifüj sırasında hücreler ve hücre bütünlüğü ve / veya etkisi hücre davranışını bozabilir yoğunluk gradyan ortamının bileşenleri yaşadığı kayma gerilmeleri. 8 Mikroakiskan sev ile cazip bir alternatifdeterministik yanal deplasman (Anti Blokaj Sistemi) 9, 10,11 dieletrophoresis ve küçük partiküllerin ayrılması ve tampon değişimi uygulamaları için geliştirilmiş 12 acoustophoresis dahil taraflı ayırma teknolojileri. Ancak, bu yöntemler düşük verim muzdarip (1-10 ul · dk – 1) ve sorunları tıkanma yatkındır. Böyle Dielektroforez tabanlı yöntemler olarak aktif ayrımları da içsel dielektroforetik hücre fenotipleri veya ayrılmasını sağlamak için ek hücre etiketleme adımlarla farklılıkları gerektirir. Karşısında parçacıkların veya hücrelerin yan göç nedeniyle yüksek akış koşulları ve üstün boyut çözünürlüğü nedeniyle yüksek Reynolds sayısı (Re) 13 baskın asansör güçleri (F L) farklı pozisyonlarda odaklanmak düzene – Daha umut verici bir yaklaşım eylemsiz mikroakışkanları içerir. , genellikle boyut temelli hücre ayırma 14,15 ve de tampon değişimi uygulamaları için istifade edilmiştir. 16-18 Howeveayrılan hücreler genellikle özgün ve yeni tampon çözeltileri arasındaki sınıra yakın kaldığı sürece r, tampon değişimi performansı ~10-30% kirletici solüsyonu ile yetersiz kalmaktadır. 16-18 Daha da önemlisi, hedef hücrelerin boyut dağılımı elde etmek için benzer olmak zorundadır özellikle mezenkimal kök hücreleri gibi heterojen boyutlu hücre tipleri (MKH) işlenmesinde bir sorunu teşkil orijinal tampon çözeltisinden hassas odaklama atalet ve ayırma. 19
Biz daha önce, yeni bir eylemsizlik Mikroakiskan hücre sıralama tekniği 2-giriş, 2-çıkış spiral mikro cihazı kullanılarak dolaşımdaki tümör hücrelerinin (KTC) tam kandan 20 ve bakteriler 21 izole etmek için Dean akış ayırma (DFF) olarak adlandırılan geliştirdik. Bu video protokolü, biz etiketleme THP-1 (insan akut monositik lösemi hücre hattı) süspansiyonu monositik hücreleri (~ 15 mikron) ve kalsein-l MKH (10-30 mikron) sürecini anlatacağızoaded NPler, işaretlenmiş hücreleri ve bağlanmamış NP kaldırılması verimli geri kazanımı için DFF sarmal mikrocihazda imalat ve işlem takip eder. 22. Bu tek aşamalı saflaştırma stratejisi etiketli süspansiyon ve santrifüj olmadan, taze tampon çözelti içinde süspanse yapışan hücrelerin sürekli bir iyileşme sağlar. Ayrıca, 10 milyon hücreleri · ml -1, bir hücre yoğunluğu rejeneratif tıp uygulamalarında mükellef kadar işleyebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen DFF hücre saflaştırma tekniği, yüksek verimli bir şekilde etiketlenmiş hücrelerin hızlı ve sürekli ayırma sağlar. Bu ayırma yaklaşımı büyük örneklem hacmi veya yüksek hücre konsantrasyonu numune işleme için idealdir ve uzun süreli kullanım sonrasında tıkanmaya meyilli olan klasik membran bazlı filtreleme daha iyidir. Benzer bir şekilde, afinite bazlı manyetik ayırma zahmetli ve pahalı ek hücre etiketleme adımları gerektirir. Saflaştırılmış hücreleri (kanal i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells’ status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
