Mikroflödesbuffertutbyte för Störningsfri Micro / nanopartiklar Cell Engineering
Summary
Detta protokoll beskriver användningen av en tröghets mikrofluidik-baserad buffertbyte strategi att rena mikro / nanopartiklar modifierade celler med effektiv utarmning av obundna partiklar.
Abstract
Modifiering av celler med aktiv ingrediens belastad mikro / nanopartiklar (NPS) blir en alltmer populär metod för att öka inhemska terapeutiska egenskaper, möjliggör bio avbildning och kontrollera cellfenotyp. En kritisk men otillräckligt adresserade frågan är det stora antalet partiklar som förblir obundet efter cellmärkning som inte lätt kan avlägsnas genom konventionell centrifugering. Detta leder till en ökning av biologisk avbildning bakgrundsbrus och kan förläna omvälvande effekter på angränsande icke-målceller. I detta protokoll presenterar vi en tröghets mikrofluidik-baserad buffertbyte strategi kallas Dean Flow fraktionering (DFF) för att effektivt separera märkta celler från fria NP i en hög genomströmning sätt. Den utvecklade spiralmikroanordning underlättar kontinuerlig samling (> 90% cellutvinning) av renade celler (THP-1 och MSC) suspenderade i ny buffertlösning, och samtidigt uppnå> 95% utarmning av obundet fluorescerande färg eller färgämne belastade NP (silica eller PLGA). Denna enda-steg, möjliggör storleksbaserad cellreningsstrategi hög cellbearbetnings genomströmning (10 6 celler / min) och är mycket användbar för produktion i stor volym cell rening av mikro / nanopartiklar modifierade celler för att uppnå störningsfri klinisk tillämpning.
Introduction
Engineering celler genom agent laddade mikro / nanopartiklar (NPS) är en enkel, genomisk integration fritt, och mångsidig metod för att förbättra Bioimaging kapacitet och öka / komplettera sina inhemska terapeutiska egenskaper i regenerativ medicin. 1-3 Cellular ändringar uppnås genom att märka plasmamembranet eller cytoplasman med ett överskott koncentration av agentbelastade NP att mätta bindningsställen. Emellertid en stor nackdel med denna metod är de betydande mängder av obundna partiklar som finns kvar i lösning efter cellmärkningsprocesser, vilket potentiellt kan omintetgöra exakt identifiering av partikel bearbetade celler eller komplicera terapeutiska resultat. 4,5 Dessutom, exponering för NP innehållande omvandlande medel (tillväxtfaktorer, kortikosteroider, etc.) vid överdrivet hög koncentration kan orsaka cytotoxicitet och missriktad exponering kan inducera oavsiktliga konsekvenser för icke-målceller. Även partikel bärare innefattande of "biokompatibla" material [t ex poly (mjölksyra sam-glykolsyra), PLGA] kan framkalla potenta immuncellsvar under vissa förhållanden. 6 Detta är särskilt riskabelt hos personer med nedsatt immunitet (t.ex. reumatoid artrit) som potentiellt förseningar systemisk nanopartikel clearance. 7 således effektivt avlägsnande av fria partiklar före införandet av partikel-engineered celler är av stor betydelse för att minimera toxicitetsprofil och reducera missriktad exponering för agentladdade partiklar in vivo.
Konventionell gradientcentrifugering används ofta för att separera manipulerade celler från fria partiklar, men är arbetskrävande och drivs i batch-läge. Dessutom skjuvspänningar upplevs av celler under höghastighetscentrifugering och beståndsdelarna i densitetsgradienten mediet kan äventyra cellernas integritet och / eller påverka cellens beteende. 8 Mikrofluidik är ett attraktivt alternativ med sevrala separationsteknik inklusive deterministiska sidoförskjutning (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 och akustofores 12 utvecklad för små partiklar separation och buffertbörstillämpningar. Men dessa metoder lider av låg genomströmning (1-10 ^ il · min – 1) och är benägna att igensättning frågor. Aktiva separationer såsom dielektrofores baserade metoder kräver också skillnader i inneboende dielektroforetisk cellfenotyper eller ytterligare cell märkning åtgärder för att uppnå separation. En mer lovande tillvägagångssätt involverar tröghets mikrofluidik – den laterala migreringen av partiklar eller celler över effektiviserar att fokusera på olika positioner på grund av dominerande lyftkrafter (F L) vid hög Reynolds tal (Re) 13 På grund av sin höga flödesförhållanden och överlägsen storlek upplösning. det har ofta utnyttjats för storleksbaserade cellseparation 14,15 och buffertbörstillämpningar. 16-18 However fortfarande buffertbyte prestanda dålig med ~10-30% förorenings lösning som de separerade cellerna förblir vanligtvis nära gränsen mellan original och ny buffertlösningar. 16-18 Ännu viktigare är storleksfördelningen av målceller måste likna uppnå precisa tröghets fokusering och separation från den ursprungliga buffertlösningen som utgör ett problem i synnerhet vid bearbetning av heterogena stor celltyper såsom mesenkymala stamceller (MSC). 19
Vi har tidigare utvecklat en ny tröghets mikrofluidik cellsortering teknik kallas Dean Flow fraktionering (DFF) för att isolera cirkulerande tumörceller (CTCs) 20 och bakterier 21 från helblod med användning av en 2-inlopp, 2-utlopp spiral mikroanordning. I den här videon protokoll, kommer vi att beskriva processen för märkning THP-1 (human akut monocytisk leukemi cellinje) suspension monocytiska celler (~ 15 pm) och MSC (10-30 um) med kalcein-loaded NP, följt av tillverkning och drift av DFF spiralmikroanordning för effektiv återvinning av märkta celler och avlägsnande av obundna NP. 22 Denna enda steg reningsstrategi möjliggör kontinuerlig återvinning av märkt suspension och vidhäftande celler suspenderade i färsk buffertlösning utan centrifugering. Dessutom kan det hantera upp till 10 miljoner celler · ml -1, en celltäthet mottagliga för regenerativ medicin applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF cell reningsteknik som beskrivs här möjliggör snabb och kontinuerlig separation av märkta celler i en hög genomströmning sätt. Denna separation metod är idealisk för stor provvolym eller hög cellkoncentration urval bearbetning, och är bättre än konventionell membranbaserad filtrering som är benägna att igensättning efter långvarig användning. På liknande sätt kräver affinitetsbaserad magnetisk separation ytterligare cellmärknings steg som är arbetskrävande och dyra. De renade cellerna visat s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells’ status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
