Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Summary

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Abstract

Thymus selectie verloopt in een unieke en zeer georganiseerde thymus micromilieu resulteert in de vorming van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire. In vitro modellen voor T lineage betrokkenheid en ontwikkeling te bestuderen hebben waardevolle inzichten in dit proces. Maar deze systemen niet de volledige driedimensionale thymus milieu noodzakelijk voor T cel ontwikkeling en derhalve onvolledig benaderingen van in vivo thymus selectie. Enkele problemen met betrekking tot modellering T cel ontwikkeling kan worden overwonnen door in situ modellen die een intact micro thymus die volledig achter de thymus ontwikkelen winkelwagentje T cellen. Thymus slice organotypische culturen aanvulling op bestaande in-situ technieken. Thymus segmenten de integriteit van de thymus corticale en medullaire gebieden en een platform voor de ontwikkeling van overlay thymocyten van een bepaald ontwikkelingsstadium of endogene Tc bestuderenells binnen een volwassen thymus micromilieu. Gezien de mogelijkheid om ~ 20 sneetjes per muis genereren, thymus plakjes presenteren een uniek voordeel in termen van schaalbaarheid voor high throughput experimenten. Verder is de relatieve gemak bij het genereren thymus plakjes en potentieel verschillende subsets thymus en andere celpopulaties overlappen van verschillende genetische achtergronden vergroot de veelzijdigheid van deze methode. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van de thymus plakjes, isolatie en bekleding van thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse. Dit systeem kan ook worden aangepast om onconventionele T cel ontwikkeling te bestuderen en thymocyten migratie thymocyt-stromale cel interacties en TCR signalen geassocieerd met thymus selectie door twee-foton microscopie te visualiseren.

Introduction

T-cellen differentiëren door een reeks van ontwikkelings tussenproducten in de thymus gedurende welke zij verschillende checkpoints dat het genereren van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire ^1-3 garanderen tegenkomen. Positieve selectie bevordert de overleving van thymocyten met T-cel receptoren (TCR) kunnen herkennen, met een lage tot matige affiniteit, peptide gepresenteerd door major histocompatibility complexe moleculen (MHC) op corticale thymus epitheelcellen (CTEC) ^2,3. Negatieve selectie en regulatoire T (T _reg) ontwikkeling cel bijdragen aan de totstandkoming van zelf-tolerantie via het wegnemen of misbruik van thymocyten die sterk reageren op self-peptide gepresenteerd door MHC ^2,4. Onrijpe CD4 ⁺ CD8 ⁺ dubbel positieve (DP) thymocyten expressie TCRs die het selectieproces overgaan differentiëren in rijpe T-cel subpopulaties, waarvan de meeste zijn MHC klasse I-beperkte CD8 ⁺ cytotoxischeof MHC klasse II beperkte CD4 ⁺ helper enkel positieve (SP) T-cellen, voor het verlaten van de thymus tot effector functies in de secundaire lymfoïde organen ^1-3.

Wat de complexiteit van T cel ontwikkeling is de dynamische migratie en cellulaire ontmoetingen ontwikkelen thymocyten gehele stromale cel netwerk ^5-9. Deze stromale cellen spelen verschillende rollen in thymocyten ontwikkeling en zijn verschillend verdeeld over de thymus corticale en medullaire regio's waar de positieve en negatieve selectie plaatsvinden ^10. Hoewel positieve selectie vindt plaats in de eerste plaats in de cortex, er is een groeiend bewijs dat DP thymocyten migreren naar het merg en blijven TCR signalen voordat ze differentiëren in mature T-cellen suggereert dat het merg extra signalen kunnen verschaffen die nodig zijn voor de voltooiing van positieve selectie en lineage differentiatie ^11,12. Verder,ondanks de aanwezigheid van gespecialiseerde medullaire thymus epitheelcellen (MTES) die expressie en huidige weefsel beperkte antigenen vergemakkelijken deletie van autoreactieve thymocyten ^13,14, een groot deel van de negatieve selectie plaatsvindt in de cortex in reactie op alomtegenwoordig tot expressie zelf peptide door dendritische cellen ^15,16. Zo moet nauwkeurige modellen van T-cel ontwikkeling een zeer georganiseerde thymus micromilieu te voorzien, met intacte corticale en medullaire regio's, dat de interactie tussen thymocyten en stromale cellen faciliteert en ondersteunt thymocyt migratie deze cellen ondergaan positieve en negatieve selectie.

Als aanvulling ex vivo analyse van thymocyten als middel bestuderen positieve en negatieve selectie, een aantal in vitro, in situ en in vivo modellen van T cel ontwikkeling ontwikkeld ^17-22. Het is altijd moeilijk recapitulerenpositieve selectie in vitro, maar co-cultuur van stamcelpopulaties of T cel voorlopers met stromale cellen die Notch-ligand, met name OP9-DL1 / 4 cellen, heeft de mogelijkheid om T lineage inzet en beperkte positieve selectie ondersteunen waardoor het een waardevol in vitro model studie T cel ontwikkeling ^23-25. Beperkingen van dit systeem omvatten echter het feit dat deze cellen het unieke peptide machines gevonden in thymus stromale cellen en de driedimensionale thymus micromilieu.

Hoewel technisch omslachtig, in situ en in vivo modellen van thymus selectie enkele obstakels met betrekking tot in vitro systemen te overwinnen. Reaggregate thymus orgel culturen (RTOC) bevatten gedefinieerde mengsels van thymocyten en thymus stromale cellen ^18,26,27. Deze thymus epitheelcellen reaggregates behouden MHC klasse I en II expressie en kan Developme ondersteunennt van zowel conventionele T-cel subsets, maar nog steeds niet gedefinieerd corticale en medullaire structuren. Foetale thymus orgaankweek (FTOC) is een populair model T cel ontwikkeling die met thymocyten via hangende-druppel cultuur lymphodepleted thymus lobben of via injectie van thymocyten kan worden gezaaid in lymphoreplete thymus lobben en ondersteunen efficiënte ontwikkeling van CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T cellen na verloop van tijd in cultuur ^18,28-31. Aan het begin van de cultuur van de foetale thymus lobben is er een gebrek aan mTECs, maar gedefinieerd corticale en medullaire structuren kunnen ontwikkelen in de tijd afhankelijk van de omstandigheden. Een belangrijke overweging is dat dit model voorkeur kan ondersteunen foetale versus volwassen T cel ontwikkeling. Tenslotte intrathymic injectie van gedefinieerde thymus voorlopers in volwassen muizen is technisch uitdagend, maar geeft duidelijk een omgeving te steunen T cel ontwikkeling in vivo. Deze in situ en in vivo modellen zijn uitstekende hulpmiddelen to studie T cel ontwikkeling en het gebruik ervan moet worden beschouwd als een experiment-by-experiment basis.

Thymus segmenten hebben echter onlangs ontwikkeld tot een veelzijdige complementair model thymus de selectie in situ met de mogelijkheid om unieke, complexe en algemeen hogere throughput experimenten tegemoet. Thymus plakjes handhaven van de integriteit van de corticale en medullaire regio's en bieden een kader van stromale cellen die thymocyten migratie ondersteunt tijdens de ontwikkeling en efficiënte positieve en negatieve selectie ^11,32-39. Thymocyt subsets toegevoegd boven op de thymus plakjes migreren in het weefsel en hun geschikte micro-omgeving niche ^34,37. De overlay thymocyten kan worden onderscheiden van de thymus segment endogene cellen via congenic merkers of fluorescente labels en kunnen in kweek gedurende enkele dagen worden gehandhaafd. Thymus slice organotypische kweken kan worden gebruikt om verschillende aspecten bestuderenT cel ontwikkeling zoals thymus keuze, thymocyten gedrag (migratie en cellulaire interacties) en thymocyten lokalisatie, onder anderen. De mogelijkheid krijgen om ~ 20 thymus segmenten per muis genereren, de schaalbaarheid van experimenten in het algemeen groter dan andere in situ modellen van thymus selectie. Hoewel de bereiding van thymus segmenten vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals de vibratome en de levensduur van thymus segmenten in cultuur beperkt blijven door celverlies tijd via celdood en het ontbreken van een inkapselend membraan, thymus segmenten vormen een uitstekend model voor de analyse van thymus selectie van gesynchroniseerde populaties van thymocyten binnen een volwassen thymus micromilieu. Hier beschrijven we de voorbereiding van de thymus plakjes (met inbegrip van het oogsten van de thymus, agarose inbedding van thymus lobben en vibratome snijden van het ingebedde weefsel), isolatie en overdeksel thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse.

Protocol

Protocollen voor alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care Comite op het Centre de recherche – Hôpital Maisonneuve-Rosemont. 1. Oogsten Muis Thymus voor de bereiding van de thymus Slices en Single Cell Schorsingen Euthanaseren de muis met CO 2 gevolgd door cervicale dislocatie. In een laminaire stroming kap, speld de muis buikzijde tot een dissectie board. Spuit de muis met 70% ethanol. Verwijder overtollig alcohol door deppen met een gaasje om te voorkomen dat etha…

Representative Results

Thymus plakjes ondersteuning analyse van de verschillende aspecten van de T-cel ontwikkeling, zoals positieve en negatieve selectie. Voor een succesvolle experimenten, de kwaliteit van de thymus slice staat voorop. Daarom moet thymus plakjes worden onderzocht om de integriteit van de thymusweefsel waarborgen en dat de agarose rond de thymus slice intact (Figuur 1A). Oppervlaktespanning kan worden aangetast wanneer de agarose beschadiging veroorzaakt ee…

Discussion

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van thymus segmenten en representatieve resultaten efficiënte positieve en negatieve selectie overlay preselectie MHC klasse-I beperkte TCR transgene thymocyten door flowcytometrie. Dit systeem is gebruikt met soortgelijke succes positieve selectie van MHC klasse II beperkte CD4 ⁺ T-cellen van voorselectie DP thymocyten ³² ondersteunen, en in aanwezigheid van agonist antigeen negatieve selectie en thymus T _reg ontwikkeling ^{11,12, 3…}

Materials

Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated – T12)	Polyciences	18986	22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm
Double Edge Prep Blades	Personna	74-0002
Tissue Adhesive	3M	1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts	BD Falcon	353090	Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine	Wisent	350-000-CL
Fetal Bovine Serum	Wisent	080-110	Heat inactivated
L-Glutamine, 200mM	Wisent	609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100X	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoethanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter	Component Supply	U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle	Bel-Art	F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340
Forceps Inox Tip	Dumont	RS-5047	Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm
Micro Forceps	Dumont	RS-5090