Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Summary

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ – Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen – Mikroskopie.

Abstract

Thymic Auswahl erfolgt in einem einzigartigen und Thymus – Mikro hoch organisierte was zur Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerante T – Zell – Repertoires. In – vitro – Modellen T – Linie Engagement und Entwicklung zu studieren , haben wertvolle Einblicke in diesen Prozess. Jedoch fehlt es diesen Systemen die vollständige dreidimensionale thymic milieu notwendig T – Zell – Entwicklung und sind daher unvollständig Approximationen in vivo Thymus – Selektion. Einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit Modellierung T – Zell – Entwicklung kann durch die Verwendung in situ Modelle überwunden werden , die eine intakte Thymus – Mikroumgebung schaffen , die vollständig Thymus Auswahl der Entwicklung eines T – Zellen unterstützt. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen ergänzen in – situ – Techniken existieren. Thymus-Scheiben, die Integrität der Thymus kortikalen und medullären Regionen erhalten und eine Plattform Entwicklung von überlagerten Thymozyten einer definierten Entwicklungsstadium oder endogener T c zu studierenells innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Aufgrund der Fähigkeit, ~ 20 Scheiben zu erzeugen pro Maus, präsentieren Thymus-Scheiben einen einzigartigen Vorteil in Bezug auf Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Experimenten. die Vielseitigkeit dieses Verfahren weiter verbessert die relative Leichtigkeit thymic Scheiben und Potential bei der Erzeugung von verschiedenen Thymus Subsets oder andere Zellpopulationen aus verschiedenen genetischen Hintergründen zu überlagern. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben, Isolierung und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die durchflusszytometrische Analyse. Dieses System kann auch als auch visualisieren Thymozyten Migration, Thymozyten-stromal Zell-Wechselwirkungen und TCR-Signale mit Thymus Auswahl durch Zwei-Photonen-Mikroskopie assoziiert zu studieren nicht-konventionellen T-Zell-Entwicklung angepasst werden.

Introduction

T – Zellen differenzieren durch eine Reihe von Entwicklungs Intermediate in den Thymus während welcher Zeit sie mehrere Prüfpunkte auftreten, die die Erzeugung eines funktionellen, selbst tolerant T – Zell – Repertoire ^1-3 gewährleisten. Positive Selektion fördert das Überleben von Thymozyten mit T – Zell – Rezeptoren (TCR) in der Lage zu erkennen, mit geringer bis moderater Affinität, Peptid durch Haupthistokompatibilitätskomplex – Moleküle (MHC) auf die kortikale Thymusepithelzellen (cTEC) ^2,3 dargestellt. Negative Selektion und regulatorischen T (T _reg) Zellentwicklung trägt zur Schaffung der Selbsttoleranz über die Eliminierung oder Abzweigung von Thymozyten , die stark auf Selbst Peptid reagieren presented by MHC ^2,4. Unreife CD4 ⁺ CD8 ⁺ doppelt positiven (DP) Thymozyten TCRs exprimieren, die den Auswahlprozess unterscheiden sich zu reifen T – Zell – Subpopulationen, die meisten davon sind MHC – Klasse – I-restringierte CD8 ⁺ zytotoxische passierenoder MHC – Klasse – II-restringierten CD4 ⁺ Helfer einzigen positiven (SP) T – Zellen, bevor die Thymusdrüse austretenden Effektor – Funktionen in den sekundären lymphatischen Organen ^1-3 auszuführen.

Zusätzlich zu der Komplexität der T – Zell – Entwicklung ist die dynamische Migration und zelluläre Begegnungen von Thymozyten ganzen Stromazellen Netzwerk ^5-9 entwickeln. Diese Stromazellen spielen verschiedene Rollen in Thymozyten Entwicklung und zwischen den Thymus kortikalen und medullären Regionen unterschiedlich verteilt , in denen positive und negative Selektion ¹⁰ auftreten. Obwohl positive Selektion in erster Linie in der Rinde nimmt, gibt es vermehrt Hinweise, dass DP Thymozyten zur Medulla migrieren und weiterhin TCR-Signale zu verlangen, bevor sie sich zu reifen T-Zellen differenzieren was darauf hindeutet, dass die Medulla notwendig, zusätzliche Signale für die Fertigstellung der positiven Selektion und Abstammung liefern kann Differenzierung ^11,12. Des Weiteren,Erleichtern Deletion autoreaktiver Thymozyten ^13,14 trotz der Anwesenheit von spezialisierten Mark Thymus – Epithelzellen (mTEC) , die und Gegenwart gewebe beschränkt Antigene exprimieren, ein großer Teil der negativen Selektion auftritt in der Hirnrinde in Reaktion auf ubiquitär exprimierten Selbst Peptid präsentiert von dendritischen Zellen ^15,16. So müssen genaue Modelle der T-Zell-Entwicklung stellen eine äußerst Thymus Mikro organisiert, mit intakter Rinde und Mark Regionen, die die Interaktion zwischen Thymozyten und Stromazellen erleichtert und unterstützt thymocyte Migration, da diese Zellen positive und negative Selektion unterzogen werden.

Zur Ergänzung der ex vivo – Analysen von Thymozyten als Mittel zum Studium positive und negative Selektion, eine Reihe von in vitro, in situ und in vivo Modelle der T – Zellentwicklung wurden ^17-22 entwickelt. Es war notorisch schwierig zu rekapitulierenpositive Selektion in vitro, aber Co – Kultur von Stammzellpopulationen oder T – Zell – Vorläufer mit Stromazellen Notch – Liganden exprimieren, insbesondere OP9-DL1 / 4 – Zellen, hat die Fähigkeit , T – Linie Engagement und begrenzte positive Selektion macht es einen unschätzbaren in – vitro – Modell zu unterstützen, Studie T – Zell – Entwicklung ^23-25. Einschränkungen dieses Systems gehören jedoch die Tatsache, dass diese Zellen die einzigartige Peptid Maschinen für die Verarbeitung fehlt in Thymus-Stroma-Zellen und die dreidimensionale Thymus-Mikroumgebung gefunden.

Obwohl technisch umständlich, in situ und in – vivo – Modellen von Thymus – Auswahl einige der Barrieren in Bezug auf in – vitro – Systemen zu überwinden. Reaggregieren Thymus – Organkulturen (RTOC) enthalten Mischungen von Thymozyten und Thymus – Stroma – Zellen ^18,26,27 definiert. Diese Thymus-Epithelzellen-reaggregates halten MHC-Klasse-I und II-Expression und developme unterstützennt beider herkömmlichen Zelluntergruppen T, aber immer noch kortikalen und medullären Strukturen nicht ausreichend definiert. Fötalem Thymus – Organkultur (FTOC) ist ein beliebtes Modell der T – Zell – Entwicklung , die mit Thymozyten über hanging-drop Kultur lymphodepleted Thymus Lappen oder durch Injektion von Thymozyten in lymphoreplete thymic Keulen und unterstützen effiziente Entwicklung von CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T ausgesät werden können Zellen im Laufe der Zeit in Kultur ^18,28-31. Bei Beginn der Kultur von fötalen Thymus Lappen gibt es einen Mangel von mTEZ, aber definierten kortikalen und medullären Strukturen können im Laufe der Zeit in Abhängigkeit von Bedingungen zu entwickeln. Eine wichtige Überlegung ist, dass dieses Modell bevorzugt im Vergleich zu Erwachsenen-T-Zell-Entwicklung fötalen unterstützen. Schließlich ist intrathymischen Injektion von definierten Thymus-Vorstufen in erwachsenen Mäusen technisch anspruchsvoll, aber stellt klar, eine Umgebung zu unterstützen T – Zell – Entwicklung in vivo. Diese in situ und in – vivo – Modelle sind hervorragende Werkzeuge to Studie T-Zell-Entwicklung und ihre Verwendung sollte an einem Experiment-by-Experiment Basis betrachtet werden.

Thymus – Scheiben haben sich jedoch heraus kürzlich als vielseitiges, komplementärer Modell thymic Auswahl in situ mit der Möglichkeit zu untersuchen einzigartig, komplex aufzunehmen, und in der Regel einen höheren Durchsatz Experimenten. Thymus – Scheiben , die Integrität der kortikalen und medullären Regionen zu erhalten und einen Rahmen von Stromazellen bereitzustellen , die Thymozyten Migration während der Entwicklung sowie effiziente positive und negative Selektion ^11,32-39 unterstützt. Thymocyte Subsets oben auf Thymus – Scheiben wandern in das Gewebe und in die entsprechenden Mikroumgebungs Nische ^34,37 hinzugefügt. Das überlagerte Thymozyten aus Thymus-slice endogene Zellen über kongenen Marker oder Fluoreszenzmarkierungen unterschieden werden und kann in Kultur für mehrere Tage aufrechterhalten werden. Thymic Scheibe organotypischen Kulturen können verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu studierenvon T-Zell-Entwicklung, einschließlich Thymus-Selektion, Thymozyten Verhalten (Migration und zellulären Wechselwirkungen) und Thymocyten-Lokalisierung, unter anderem. In Anbetracht der Fähigkeit ~ 20 Thymus – Scheiben zu erzeugen pro Maus, ist die Skalierbarkeit von Experimenten im Allgemeinen größer als andere in situ Modelle von Thymus – Auswahl. Obwohl die Herstellung von Thymus slices spezialisierte Ausrüstung erfordert, wie dem Vibratom und die Lebensdauer der Thymus-Scheiben in Kultur begrenzt ist, zu einem Verlust von Zellen im Laufe der Zeit über den Zelltod aufgrund und das Fehlen einer einkapselnden Membran bereitzustellen thymic Scheiben ein ausgezeichnetes Modell zur Analyse von Thymus Auswahl von synchronisierten Populationen von Thymozyten innerhalb eines reifen Thymus-Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Herstellung von Thymus-Scheiben (einschließlich Ernten des Thymus, Agarose Einbettung von Thymus Lappen und Vibratom Schnitte des eingebetteten Gewebe), Isolation und Überlagerung von Thymozyten und Dissoziation von Thymus-Scheiben für die Durchflusszytometrie-Analyse.

Protocol

Hôpital Maisonneuve-Rosemont – Protokolle für alle Tierstudien wurden von der Animal Care Committee am Centre de recherche genehmigt. 1. Die Ernte Maus Thymus für Herstellung von Thymus-Scheiben und Einzelzellsuspensionen Euthanize die Maus mit CO 2 durch Genickbruch folgte. In einer Laminar-Flow-Haube, Pin mit der Maus Bauchseite zu einer Dissektion Brett. Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Entfernen überschüssigen Alkohols durch Abtupfen mit Gaze ethanol vom Eintritt in…

Representative Results

Thymus slices Unterstützung Analyse verschiedener Aspekte der T-Zell-Entwicklung, wie beispielsweise positive und negative Selektion. Für eine erfolgreiche Versuche, die Qualität des Thymus-Scheibe von größter Bedeutung. Somit sollte thymic Scheiben untersucht werden , um die Integrität des Thymusgewebe zu gewährleisten , und dass die Agarose die Thymus – slice (1a Abbildung) intakt umgibt. Oberflächenspannung kann beeinträchtigt werden, wenn …

Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Thymus Scheiben und repräsentative Ergebnisse effizienter positive und negative Selektion von überlagerten Vorselektion MHC-Klasse-I-restringierten TCR transgene Thymozyten durch Durchflusszytometrie. Dieses System wurde mit ähnlichem Erfolg verwendet , um eine positive Selektion von MHC – Klasse – II-restringierte CD4 ⁺ T – Zellen von Vorselektion DP Thymozyten ³² und, in Gegenwart von Agonist – Antigen, negative Selektion und thymic T…

Materials

Vibratome	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated – T12)	Polyciences	18986	22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm
Double Edge Prep Blades	Personna	74-0002
Tissue Adhesive	3M	1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts	BD Falcon	353090	Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine	Wisent	350-000-CL
Fetal Bovine Serum	Wisent	080-110	Heat inactivated
L-Glutamine, 200mM	Wisent	609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100X	Wisent	450-201-EL
2-Mercaptoethanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders	Wheaton	357426
Nylon Mesh Filter	Component Supply	U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle	Bel-Art	F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer	BD Falcon	352340
Forceps Inox Tip	Dumont	RS-5047	Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm
Micro Forceps	Dumont	RS-5090