준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램
Summary
우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.
Abstract
기능, 자기 허용 T 세포 레퍼토리의 생성의 결과로 독특하고 고도로 조직화 된 흉선 미세 환경에서 흉선 선택 진행한다. T 계보의 헌신과 개발을 연구하는 체외 모델은이 과정에 귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 그러나, 이러한 시스템은 T 세포의 발달에 필요한 완전한 입체 흉선 환경이 부족하고, 따라서, 생체 내 선택 흉선 불완전 근사치이다. 모델링 T 세포의 개발과 관련된 문제들 중 일부는 전체 T 세포 개발 흉선 선택을 지원 온전한 흉선 미세 제공 시츄 모델을 사용하여 극복 될 수있다. 흉선 슬라이스의 Organotypic 문화는 현장 기술에 기존의 보완. 흉선 조각은 흉선 피질과 수질 지역의 무결성을 보존하고 정의 발달 단계 또는 내인성 T (c)의 중첩 흉선 세포의 개발을 연구 할 수있는 플랫폼을 제공성숙한 흉선 미세 환경 내에서 ELL 학생. 마우스 당 20 ~ 슬라이스를 생성 할 수있는 능력이 주어 흉선 슬라이스 높은 처리량 실험 성 측면에서 고유 한 이점을 제시한다. 또한, 다양한 유전 적 배경에서 다른 흉선의 서브 세트 또는 다른 세포 집단을 오버레이 흉선 조각과 잠재력을 생성하는 상대적 용이성이 방법의 다양성을 향상시킨다. 여기에서 우리는 흉선 조각, 격리 및 흉선 세포의 오버레이 및 유세포 분석을위한 흉선 조각 해리의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 흉선 세포 이주, 흉선 세포 – 실질 세포의 상호 작용 및 이광자 현미경 흉선 선택과 연관된 TCR 신호의 비 통상적 인 T 세포의 발달을 연구뿐만 아니라 가시화하도록 구성 될 수있다.
Introduction
T 세포는 기능성 자기 저항성 T 세포 레퍼토리 1-3의 생성을 위해 여러 체크 포인트가 발생하는 시간 동안 흉선 발달 중간체 일련 구별. 긍정적 인 선택은 대뇌 피질의 흉선 상피 세포 (CTEC) 2,3에 주요 조직 적합성 복합체 분자 (MHC)에 의해 제공 온건 친 화성 펩타이드에 저와, 인식 할 수있는 T 세포 수용체 (TCR)와 흉선 세포의 생존을 촉진한다. 음의 선택 및 규제 T (T REG) 세포 개발은 MHC 2,4 제시 자체 펩타이드에 강력하게 대응 흉선 세포의 제거 또는 전환을 통해 자기 관용의 설립에 기여한다. 미성숙 한 CD4 + CD8 + 더블 양성 (DP)은 성숙한 T 세포의 소집단으로 선정 과정을 통과 차별화 TCR도를 발현하는 흉선 세포,있는 MHC 클래스 I가 제한 CD8 + 세포 독성 대부분입니다또는 MHC 클래스 차 림프 기관 1-3 이펙터 기능을 수행하는 흉선을 종료하기 전에 CD4 + 헬퍼 단일 양성 (SP) T 세포를 II 제한.
T 세포 개발의 복잡성을 추가 동적 이동과 간질 셀 네트워크에 걸쳐 5-9 흉선 개발 셀룰러 조우한다. 이러한 기질 세포는 흉선 세포 개발에 뚜렷한 역할을하고 차별적 긍정적이고 부정적인 선택 (10)를 발생하는 흉선 피질과 수질 영역 사이에 분포한다. 긍정적 인 선택은 주로 피질에서 발생하지만, DP의 흉선 세포는 골수로 마이그레이션하고는 수질이 긍정적 인 선택과 혈통의 완료에 필요한 추가 신호를 제공 할 수 있음을 시사 성숙한 T 세포로 분화하기 전에 TCR 신호를 필요로 계속 축적 증거가있다 분화 11, 12. 더욱이,자기 반응성 흉선 세포 (13, 14)의 삭제를 용이하게 표현 전문 수질 흉선 상피 세포 (mTEC)와 현재의 조직 제한 항원의 존재에도 불구하고, 부정적인 선택의 큰 비율은 보편적으로 자기 펩타이드는 수지상 제시 표현에 대한 응답에서 피질에서 발생 세포 (15, 16). 따라서, T 세포 발달의 정확한 모델은 흉선 세포 및 간질 세포 사이의 상호 작용을 용이하게하고, 이러한 세포를 양성 및 음성 선별을 거쳐으로서 흉선 세포 이동을 지원 그대로 피질 및 수질 영역으로 고도로 조직화 흉선 미세 환경을 제공해야한다.
생체 보완 반응계에서, 포지티브 및 네거티브 선택, 시험관들을 연구하는 수단으로서 흉선 세포 분석 및 T 세포 발달의 생체 내 모델에서 17-22을 개발되어왔다. 요점을 되풀이하기 어렵기로 악명이있다긍정적 인 체외에서 선택하지만, 노치 리간드를 발현하는 줄기 세포 집단 또는 기질 세포와 T 세포 전구체의 공 배양, 특히 OP9-DL1가 / 4 세포로 체외 모델에에게 귀중한을 T 계보의 헌신과 제한된 양의 선택을 지원하는 기능이 있습니다 연구 T 세포 개발 23-25. 이 시스템의 한계는, 그러나, 이들 세포는 흉선 간질 세포에서 발견되는 고유 펩타이드 처리 장치 및 입체 흉선 미세 부족하다는 점을 포함한다.
기술적으로 복잡, 시험 관내 시스템에 관한 장벽들을 극복 할 수있는 동일계 및 흉선 선택의 생체 내 모델에서 비록. 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC)는 흉선 세포와 흉선 간질 세포 18,26,27의 혼합물 정의가 들어 있습니다. 이 흉선 상피 세포 reaggregates는 MHC 클래스 I 및 II 식을 유지하고 developme에 지원할 수 있습니다NT를 모두 기존의 T 세포 하위 집합으로, 그러나 아직도 피질과 수질 구조를 정의 부족합니다. 태아 흉선 기관 문화 (FTOC)은 lymphoreplete 흉선 로브에 lymphodepleted 흉선 로브 또는 흉선 세포의 주입을 통해 매달려 놓기 문화를 통해 흉선 세포의 시드와 CD4 +와 CD8 + T의 효율적인 개발을 지원할 수있는 T 세포 발달의 인기 모델입니다 문화 18,28-31에서 시간이 지남에 따라 세포. 태아 흉선 로브의 문화의 개시에 mTECs의 소수가 있지만, 정의 피질과 수질 구조는 조건에 따라 시간이 지남에 개발할 수 있습니다. 중요한 고려 사항이 모델 우선적 성인 T 세포 발달 대 태아 지원할 수 있다는 것이다. 마지막으로, 성인 마우스에서 정의 된 흉선 전구체의 intrathymic 주입은 기술적으로 도전하지만 명확하게 지원하는 환경을 제공합니다 생체 내에서 T 세포의 발달. 현장 및 생체 모델이 우수한 도구 t이다O 연구 T 세포의 발달 및 사용은 실험별로 실험을 기초로 고려되어야한다.
흉선 슬라이스 그러나 최근 고유 복잡하며, 일반적으로 높은 처리 실험을 수용 할 가능성 시츄 흉선 선택을 연구하는 다목적 상보 모델로 떠오르고있다. 흉선 슬라이스 피질 및 수질 영역의 무결성을 유지 및 개발뿐만 아니라 효율적인 양성 및 음성 선별 11,32-39 동안 흉선 세포 이동을 지원하는 간질 세포의 프레임 워크를 제공한다. 흉선 조각 꼭대기에 추가 흉선 세포의 부분 집합은 조직에 자신의 적절한 미세 환경 틈새 34, 37로 마이그레이션 할 수 있습니다. 오버레이는 흉선 congenic 표지 또는 형광 라벨을 통해 슬라이스 내인성 흉선 세포로부터 구별 할 수 있고, 몇 일 동안 배양 유지할 수있다. 흉선 슬라이스의 Organotypic 배양 물은 다양한 양상을 연구하기 위해 사용될 수있다다른 사람의 사이에서 흉선 선택, 흉선 세포 행동 (이동과 세포의 상호 작용), 및 흉선 세포 현지화를 포함한 T 세포 개발. 마우스 당 20 ~ 흉선 슬라이스를 생성 할 수있는 능력이 주어 실험의 확장 성 흉선 선택 시츄 모델에서 다른 것보다 일반적으로 크다. 흉선 조각의 제조 전문 등 vibratome 같은 장치, 및 세포 사멸을 통해 시간에 따른 세포의 손실 및 캡슐화 막 부족으로 인해 제한되어 배양 흉선 슬라이스의 수명 시간을 필요로하지만, 흉선 슬라이스 우수한 모델을 제공 성숙한 흉선 미세 환경 내에서 흉선 세포의 동기화 인구의 흉선 선택의 분석. 여기에서 우리는 유세포 분석을위한 흉선 조각, 격리 및 흉선 세포의 오버레이 및 해리 (흉선, 흉선 로브의 아가로 오스 삽입 및 내장 조직 vibratome 절편을 수확 포함) 흉선 조각의 준비에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 흉선 조각 및 유동 세포 계측법에 의해 중첩 사전 선택 MHC 클래스 I 제한 TCR 유전자 변형 흉선 세포의 효율적인 양성 및 음성 선택의 대표적인 결과의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 시스템은 작용제 항원 음성 선별 및 흉선 T에 등록 개발 11,12의 존재하에 예비 선택 DP의 흉선 (32)로부터 MHC 클래스 II 제한 CD4 + T 세포의 양성 선별을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
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