Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
Der adoptive Transfer von ex vivo expandierte autologe Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) können dauerhafte und vollständige Antworten in signifikanten Untergruppen von Patienten mit metastasierendem Melanom vermitteln. Haupthindernisse dieses Ansatzes sind die reduzierte Lebensfähigkeit der übertragenen T-Zellen, durch Verkürzung der Telomere verursacht wird, und die begrenzte Anzahl von TILs von Patienten erhalten. Weniger differenzierte T-Zellen mit langen Telomeren wäre eine ideale T-Zell-Untergruppe für Adoptiv T-Zell-Therapie sein, aber die Erzeugung einer großen Anzahl von diesen weniger differenzierten T-Zellen problematisch ist. Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), die selbst zu erneuern, halten Pluripotenz, haben verlängert die Telomere, und bieten eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie überwunden werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll iPSCs zu erzeugen unter Verwendung von Sendai-Virus-Vektoren für die Transduktion von Reprogrammierungsfaktoren in TIL. Dieses Protokoll generierens vollständig neu programmiert, vektorfreie Klone. Diese TIL stamm iPSCs könnte in der Lage sein, zu erzeugen weniger differenzierten Patienten- und tumorspezifische T-Zellen für die adoptive T-Zell-Therapie.
Introduction
Reprogrammierung Technologie , die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS – Zellen) über die Überexpression eines definierten Satz von Transkriptionsfaktoren erlaubt ist sehr vielversprechend im Bereich der zellbasierten Therapien 1,2. Diese iPS – Zellen zeigen Transkriptions und epigenetische Merkmale und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Pluripotenz, ähnlich wie embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) 3-5. Bemerkenswerte Fortschritte bei der Reprogrammierung Technologie im letzten Jahrzehnt gemacht hat uns menschliche iPS – Zellen auch aus ausdifferenzierten Zellen, wie T – Zellen 6-8 zu erzeugen , erlaubt. T – Zellen abgeleiteten iPSCs (TiPSCs) die gleiche Konfiguration neu angeordnet T – Zell – Rezeptor (TCR) Kettengene wie die ursprünglichen T – Zellen behalten, die Regeneration von antigen-spezifischen T – Zellen aus TiPSCs 9-11 ermöglicht.
Fast 80% der Melanom-infiltrierenden Lymphozyten (TILs), erhalten von einem Patienten Tumor speziell tumorassoziierten Antigenen erkennen and halten Zytotoxizität gegen den ursprünglichen Krebszellen 12. Bemerkenswerterweise wurde die Expression des programmierten Zelltods protein-1 (PD-1) auf TILs fand die autologe Tumor-reaktiven Repertoire, einschließlich mutierter Neoantigen-spezifischen CD8 + Lymphozyten identifiziert 13. Der adoptive Transfer von Ex-vivo expandierte autologe TIL in Kombination mit präparativen lymphodepleting Regimen und systemische Verabreichung von Interleukin-2 (IL-2) kann in Untergruppen von Patienten 14 erhebliche Regression von metastatischem Melanom verursachen. Trotz Ergebnisse in präklinischen Modellen zu fördern und bei Patienten, schlechte Überleben infundiert T-Zellen und die Existenz von immunsuppressiven Wege erscheinen, das volle Potenzial von Adoptiv T-Zell-Therapie nicht zu gefährden. Aktuelle klinische Protokolle erfordern umfangreiche ex vivo Manipulation von autologe T – Zellen, um eine große Zahl zu erhalten. Dies resultiert in der Erzeugung von terminal differenzierten T-Zellen, die eine schlechte Überleben haben, reduziert proliferative Kapazität und ein hohes Maß an PD-1 15.
Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von iPS-Zellen überwunden werden, die eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie zur Verfügung stellen kann. Wir haben vor kurzem berichtet , die Umprogrammierung von Melanomen TIL, die hohe Niveaus von PD-1 von Sendai – Virus (SeV) vermittelter Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC 16. Während Retrovirusvektoren Integration in Wirtschromosomen erfordern Umprogrammierung Gene, SeV Vektoren sind zum Ausdruck bringen nicht-integrierenden und werden schließlich aus dem Zytoplasma eliminiert. Umprogrammieren Effizienz ist viel höher mit einem SeV – System im Vergleich mit Lentiviren oder Retrovirusvektoren 6-8. Weiterhin kann SeV spezifisch T – Zellen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) umprogrammieren, während einige iPSC Klone durch Lentivirus oder Retrovirus – Vektoren erzeugt aus nichtlymphoiden Linien 6-8 sein kann. Hier stellen wir Detaildie Verfahren zur Isolierung und Aktivierung von menschlichen Melanom TILs und zur Erzeugung von TIL stamm iPSCs unter Verwendung eines SeV Umprogrammierung System implementiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir gezeigt, ein Protokoll für die Umprogrammierung Melanom TIL zu iPS-Zellen von SeV-vermittelte Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC. Dieser Ansatz, der eine SeV – System unter Verwendung von T – Zellen umprogrammieren, bietet den Vorteil einer nicht-integrierenden Verfahren 7.
Eine frühere Studie zeigte , dass ein SeV Umprogrammierung System war sehr effizient und zuverlässig nicht nur Fibroblasten neu zu programmieren , sond…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
References
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