Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
A transferência adoptiva de expandidas ex vivo linfócitos infiltrantes tumorais autólogas (TIL) podem mediar respostas duráveis e completas em subconjuntos significativos de pacientes com melanoma metastático. Os principais obstáculos desta abordagem são a viabilidade reduzida das células T transferidas, causada pelo encurtamento dos telómeros, e o número limitado de TILs obtidos a partir de pacientes. As células T menos diferenciadas com longos telómeros seria um subconjunto de células T ideal para terapia adoptiva de células T, no entanto, a geração de grandes números de células T estas menos diferenciadas é problemática. Esta limitação da terapia celular adotiva T pode ser, teoricamente, superado usando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que se auto-renovar, manter os telômeros pluripotência, foram alongadas, e fornecer uma fonte ilimitada de células T autólogas para imunoterapia. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar iPSCs usando vetores de vírus Sendai para a transdução de fatores de reprogramação em TIL. Este protocolo gerars clones totalmente reprogramadas, livre do vector. Estes iPSCs TIL derivados podem ser capazes de gerar células T específicos do paciente e de tumor menos diferenciadas para terapia adoptiva de células T.
Introduction
Tecnologia de reprogramação celular que permite a geração de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs) através de sobre-expressão de um conjunto definido de factores de transcrição é uma grande promessa no domínio das terapias à base de células 1,2. Estes iPSCs exibem características de transcrição e epigenéticos e ter a capacidade de auto-renovação e pluripotência, semelhante às células estaminais embrionárias (CES) 3-5. Progressos notáveis em tecnologia de reprogramação durante a última década nos permitiu gerar iPSCs humanos, mesmo a partir de células terminalmente diferenciadas, como células T 6-8. IPSCs derivadas de células T (TiPSCs) reter a mesma configuração rearranjados de genes das cadeias do receptor de célula T (TCR), como as células T originais, o que permite a regeneração de células T específicas para o antigénio de TiPSCs 9-11.
Cerca de 80% de linfócitos infiltrantes de melanoma (TIL) obtidos a partir de tumor de um paciente reconhecem especificamente antígenos associados a tumores umnd manter a citotoxicidade contra as células cancerosas originais 12. Notavelmente, a expressão de morte celular programada proteína-1 (DP-1) em TILs foi encontrada para identificar o repertório de tumor autólogo-reactivo, incluindo CD8 específicas do neo-antigénio mutado linfócitos + 13. A transferência adoptiva de ex-vivo TILs autólogos expandidos em combinação com regimes lymphodepleting preparativa e a administração sistémica de interleucina-2 (IL-2) pode causar regressão substancial de melanoma metastático em subconjuntos de pacientes 14. Apesar resultados encorajadores em modelos pré-clínicos e em pacientes, pobre sobrevivência de células T infundidos e a existência de vias imunossupressores parecem comprometer todo o potencial da terapia celular adoptiva t. Protocolos clínicos em curso exige uma extensiva manipulação ex vivo de células T autólogas, a fim de obter um grande número. Isto resulta na geração de células T terminalmente diferenciadas que têm baixa sobrevivência reduzida, Prolcapacidade iferative, e altos níveis de PD-1 15.
Esta limitação da terapia celular adotiva T pode ser, teoricamente, superado usando iPSCs que podem fornecer uma fonte ilimitada de células T autólogas para imunoterapia. Recentemente, relatou a reprogramação de melanoma TIL expressando altos níveis de PD-1 por vírus Sendai (vários) transdução mediada por um dos quatro fatores de transcrição, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 e C-MYC 16. Enquanto vetores retrovirais requerem integração cromossomas do hospedeiro para expressar genes de reprogramação, vetores SEV são não-integração e, eventualmente, são eliminados do citoplasma. A reprogramação da eficiência é muito maior com um sistema de SeV comparação com lentivírus de retrovírus ou vectores 6-8. Além disso, SeV pode reprogramar especificamente células T em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), enquanto alguns clones IPSC gerados por lentivírus ou vectores retrovirais pode ser a partir de linhagens não linfóides 6-8. Aqui, nós detalheos procedimentos realizados para o isolamento e a activação de TIL de melanoma humano e para a geração de iPSCs TIL derivadas utilizando um sistema de reprogramação SeV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, demonstramos um protocolo para a reprogramação TIL de melanoma de iPSCs por transdução mediada por SeV dos quatro factores de transcrição OCT3 / 4, SOX2, KLF4, e c-myc. Esta abordagem, utilizando um sistema de SeV para reprogramar células T, oferece a vantagem de um método não-integrando 7.
Um estudo anterior mostrou que um sistema de reprogramação SeV foi altamente eficiente e confiável para reprogramar fibroblastos não só, mas também as células T do sangue …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
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