דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים
Summary
The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.
Abstract
העברת מאמצת של vivo לשעבר מורחבת לימפוציטים עצמיים שחדר-גידול (TILs) יכולה לתווך תגובות יציבות ומלאות תת משמעותי של חולים עם מלנומה גרורתית. מכשולים עיקריים של גישה זו הם כדאיים המופחתת של תאי T להעברה, הנגרמים על ידי קיצור הטלומרים, והמספר המצומצם של TILs המתקבל חולה. פחות בדיל תאי T טלומרים ארוכים יהיו משנה תאי T אידיאלי עבור טיפול בתאים T מאמצת, אולם יצירת מספר גדול של תאי T פחות בדיל אלה הן בעייתית. מגבלה זו של טיפול T תא מאמצת ניתן להתגבר באופן תיאורטי על ידי תאי גזע מושרים אלקטרוניים (iPSCs) כי עצמי לחדש, לשמור pluripotency, יש טלומרים מוארכים, ומהווה מקור בלתי מוגבל של תאי T עצמיים עבור חיסוני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור iPSCs באמצעות וקטורי וירוס סנדאי עבור התמרה של גורמי תכנות מחדש לתוך TILs. פרוטוקול זה ליצורזה מלא לתכנות מחדש, שיבוטים וקטור חינם. TIL נגזר אלה iPSCs עלול להיות מסוגל לייצר פחות בדיל בפציינט, ואת הגידול ספציפי תא T עבור טיפול בתא מאמצת T.
Introduction
הטכנולוגיה לתכנות מחדש של תאים המאפשר דור של תאי גזע מושרים (iPSCs) דרך ביטוי יתר של קבוצה מוגדרת של גורמי שעתוק טומן בחובו הבטחה גדולה בתחום טיפולים מבוססי תאים 1,2. IPSCs אלה להפגין תכונות תעתיק ו אפיגנטיים ויש להם את היכולת התחדשות עצמית pluripotency, בדומה לתאי גזע עובריים (ESCs) 3-5. התקדמות מרשימה שנעשו בטכנולוגיה תכנות מחדש בעשור האחרון אפשרה לנו ליצור iPSCs האנושית אפילו תאים מובחנים סופני, כגון תאי T 6-8. T תאים שמקורם iPSCs (TiPSCs) לשמור על אותה התצורה מחדש של קולטן תא T (TCR) גני שרשרת כמו תאי T המקוריים, אשר מאפשרת התחדשות של תאי T אנטיגן ספציפי מן TiPSCs 9-11.
כמעט 80% של לימפוציטים שחדר מלנומה (TILs) המתקבל גידול של המטופל במיוחד להכיר אנטיגנים גידולים הקשוריםnd לשמור cytotoxicity נגד תאי הסרטן המקורי 12. יש לציין, כי הביטוי של-1 חלבון מוות תאי מתוכנת (PD-1) על TILs נמצא לזהות את רפרטואר גידול-reactive העצמי, כולל CD8 neoantigen ספציפי מוטציה + לימפוציטים 13. העברת מאמצת של TILs העצמי המורחב לשעבר vivo בשילוב עם משטרי lymphodepleting preparative ומנהל מערכתי של אינטרלויקין -2 (IL-2) יכולה לגרום רגרסיה משמעותית של מלנומה גרורתית תת קבוצות של חולים 14. למרות תוצאות מעודדות במודלים פרה ובחולים, הישרדות עניה של תאי T החדורים וקיומה של מסלולים מדכאים חיסון להופיע להתפשר את מלוא הפוטנציאל של טיפול בתא מאמצת T. פרוטוקולים קליניים נוכחי דורשים מניפולציה vivo לשעבר נרחב של תאי T עצמיים על מנת לקבל מספר גדול. זו תוצאה של הדור של תאי T בדיל סופנים שיש הישרדות עניה, prol מופחתקיבולת iferative, ורמות גבוהות של PD-1 15.
מגבלה זו של טיפול T תא המאמצת ניתן להתגבר באופן תיאורטי באמצעות iPSCs שיכול לספק מקור בלתי מוגבל של תאי T עצמיים עבור חיסוני. דיווחנו תכנות מחדש לאחרונה של מלנומה TILs להביע רמות גבוהות של PD-1 על ידי וירוס סנדאי (SEV) התמרה בתיווך מארבעת גורמי שעתוק, OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc 16. בעוד וקטורים רטרווירוס דורשים אינטגרציה לתוך הכרומוזומים מארחים לבטא גני תכנות מחדש, וקטורי sev הנם ללא שילוב ולבסוף מסולקות מן הציטופלסמה. תכנות מחדש יעילות גבוהה בהרבה עם מערכת sev לעומת וקטורי lentivirus או רטרו-וירוס 6-8. יתר על כן, sev יכול במיוחד לתכנת מחדש תאי T בתאים דם היקפיים mononuclear (PBMCs), בעוד כמה שיבוטים iPSC שנוצר על ידי lentivirus או וקטורים רטרווירוס יכול להיות משורות nonlymphoid 6-8. כאן, אנו בפירוטהנהלים מיושמים עבור הבידוד והפעלת TILs מלנומה אנושי לייצור iPSCs TIL הנגזר באמצעות מערכת תכנות מחדש sev.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, הראינו פרוטוקול תכנות מחדש מלנומה TILs כדי iPSCs ידי התמרה בתיווך sev של שעתוק ארבעה גורמים OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc. גישה זו, באמצעות מערכת sev לתכנת מחדש תאי T, מציעה את היתרון של שיטת שילוב אי 7.
מחקר קודם הראה כי מערכת תכנות מחדש sev הי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.
Materials
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Primate ES Cell Medium | Reprocell | RCHEMD001 | warm in 37 ℃ water bath before use |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 | |
| ReproStem | Reprocell | RCHEMD005 | warm in 37 ℃ water bath before use |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
