פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם
Summary
דו"ח זה מתאר פרוטוקול מעוקב להבהיר ביופסיות עור עכבר בעובי מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון, תאים מתרבים, ו sebocytes ברזולוצית התא הבודדה ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי.
Abstract
העור הוא חיוני להישרדות שלנו. השכבה החיצונית באפידרמיס מורכב האפידרמיס interfollicular, שהנה אפיתל קשקשיים מרובדת המכסה את רוב הגוף שלנו, ואת הנספחים אפידרמיס כגון זקיקי השיער ובלוטות זיעה. האפידרמיס עובר התחדשות לאורך כל החיים בתגובה לפציעה. זו מופעלת כברירת K14 להביע אוכלוסיות תאי גזע / אב אפידרמיס הבזליים כי מוסדרים באופן הדוק על ידי מנגנוני ויסות מספר פעילים בתוך האפידרמיס בין האפידרמיס הדרמיס. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לברר ביופסיות עור בעובי עכבר מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון K14, Ki67 שכותרתו מתרבה תאים, הנילוס האדום שכותרתו sebocytes, ו DAPI תיוג גרעיני ברזולוצית תא בודדת ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת וכימות של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי. הפרוטוקול מעוקב הוא הדואר טוב ביותר השיטה זמינה עד כה כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות תאיות ב ביופסיות עור בעובי מלאות ברזולוצית תא בודדת.
Introduction
העור הוא חיוני להישרדות שלנו. הוא מורכב משלושה רבדים עיקריים האפידרמיס החיצוני, בדרמיס ובהיפודרמיס. האפידרמיס היא רקם משובים מאוד. זהו אפיתל מרובדת קשקש, המורכב בעיקר של קרטינוציטים. קרטינוציטים נולדים בשכבת הבסיס, ולעבור כלפי מעלה דרך שכבות suprabasal תוך הבחנה, ובסופו של דבר הם שופכים בשכבת cornified החיצונית כחודש לאחר הלידה שלהם. האפידרמיס מפתחת מספר נספחים כולל זקיקי השיער ובלוטות חלב. זקיקי השיער גם להתחדש באופן מחזורי לאורך כל החיים 1. קיבולת ההתחדשות של האפידרמיס מופעלת על ידי נוכחות של תאי גזע ובתאים נמצאים בשכבת הבסיס של האפידרמיס interfollicular ושיער זקיק 2.
מסלולי איתות רבים היו מעורבים בפיתוח אפידרמיס והתחדשות. חלקם מתרחשים בתוךהאפידרמיס בלבד, כגון מסלול הקיפוד. אירועי איתות אחרים מתקיימים בין הדרמיס לאפידרמיס 3. לדוגמא, אותות Wnt מן הדרמיס נחשבים חשוב להתפתחות זקיק שיער, והם מופרשים על ידי פטמית עורי בתחילת anagen להפעיל התפשטות תאי זקיק שיער בליטת גזע / ובתאים וצמיחת זקיק שיער 4. חשוב להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים השולטים בהתפתחות אפידרמיס והתחדשות כדי להבין טוב יותר כיצד הם עשויים להיות מוטרדים במחלת עור משובים כגון סרטן העור.
מאמר זה מתאר ליר C, U nobstructed קוקטיילי B גשם ואני maging ו- C ניתוח omputational (מעוקב) פרוטוקול 5-7 להבהיר הכנות עור הר שלמות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון ב 3 ממדים ברזולוצית תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. השיטה מעוקב כרוכה טבילה של עוררקמות בשני בקבוקים כימיים מבוסס aminoalcohol. פתרונות אלה להתאים את המדדים השבירים במדגם העור, משאירים את הרקמה שקופה והחלבונים ללא פגע, המאפשר immunodetection ברזולוצית תא בודד.
שימוש בפרוטוקול מעוקב זה, הבסיס, מתרבים אוכלוסיות keratinocyte באפידרמיס interfollicular ובסופו של זקיק השיער הם צילמו ב ביופסיות עור בעובי מלא של עכברים wildtype באמצעות אנטי Keratin14 (K14) ונוגדנים אנטי Ki67. בלוטות החלב ב ביופסיות עור wildtype היו דמיינו גם באמצעות מכתים האדום הנילוס. לבסוף, אוכלוסיות keratinocyte הבסיס ב wildtype ו hyperplastic YAP2-5SA-ΔC ביופסיות עור הושוו 8.
פרוטוקול מעוקב זה מאפשר הערכה חזותית של ביטוי חלבון ביופסיות עור בעובי מלאה ברזולוצית תא בודדת, והוא מהווה כלי חשוב להעריך האנטומיה אפידרמיס ופגמים מורפולוגיים בעור מהונדס גנטיעכברים, וכדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים שבבסיס התפתחות אפידרמיס והתחדשות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המנגנונים הרגולטוריים שליטת פיתוח הומאוסטזיס עור נלמדים הנפוץ ביותר 2D באמצעות חתך רקמות מכתים היסטולוגית או תיוג עם נוגדנים, המאפשר רק הערכה מוגבלת של מורפולוגיה עור, אוכלוסיות תאים או ביטוי חלבון. מספר שיטות פותחו כדי לשפר את להדמיה של הארגון המרחבי של תאים וחלבונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אוסטרליים ביו-משאבים (Garvan מכון, אוסטרליה), מרכז המשאבים הביולוגי (אוסטרליה UNSW) ואת הטיפול בבעלי החיים & ועדת אתיקה לתמיכה בניסויים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר בריאות הרפואית של אוסטרליה (פרויקט גרנט APP1062720). ד"ר סזאר פ Canales הוא מקבלי מלגה צ'ילה CONICYT-Becas (# 72,101,076). מר באסם Akladios היא כלת פרס לתארים מתקדמים הבינלאומי של אוניברסיטת ידי UNSW אוסטרליה.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
