KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller
Summary
Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.
Abstract
Cildimiz yaşam için esastır. Dış epidermal tabaka, saç folikülleri ve ter bezleri gibi vücudumuzda ve epidermal uzantıları en kapsayan bir çok katlı yassı epitel olan interfolliküler epidermis oluşur. Epidermis ömrü boyunca ve yaralanmaya yanıt olarak rejenerasyon uğrar. Bu sıkı epidermis içinde ve epidermis ve dermis arasındaki birden çok etkin düzenleyici mekanizmalar tarafından düzenlenir bazal epidermal kök / progenitör hücre popülasyonlarının K14-ifade ederek etkindir. Bu makale tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve K14 protein ekspresyonu görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanır, Ki67 hücrelerin hızla çoğalan etiketli, Nil Kırmızı Sebositler etiketli ve 3D tek hücre çözünürlükte DAPI nükleer etiketleme. Bu yöntem, doğru bir değerlendirme ve cilt anatomi ve patoloji ölçümü ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri sağlar. KÜBİK protokol thtek bir hücre çözünürlükte tam kalınlıkta deri biyopsilerinde moleküler ve hücresel etkileşimleri araştırmak için bugüne kadar mevcut e en iyi yöntem.
Introduction
Cildimiz yaşam için esastır. Bu üç ana tabaka, dış epidermis, dermiş ve deri altı oluşur. epidermis oldukça rejeneratif dokudur. Çoğunlukla keratinositlerde oluşan bir skuamöz tabakalı epitel olduğunu. Keratinositler bazal tabakada doğmuş ve ayırt ederken bazal üstü katmanları üzerinden yukarı doğru hareket, ve sonunda onların doğumdan sonra yaklaşık bir ay dış boynuzlaşan katmanda dökülür vardır. Epidermis, saç foliküllerinin ve yağ bezleri içeren uzantıları bir dizi geliştirir. Saç köklerinin de hayat 1 boyunca döngüsel bir şekilde yeniden. Epidermisin rejeneratif kapasitesinin interfolliküler epidermis ve saç folikülü 2 bazal tabakasında bulunan kök ve projenitör hücrelerinin varlığı ile sağlanır.
Birçok sinyalleme hatları, epidermal gelişim ve yenilenme implike edilmiştir. Bunlardan bazıları içinde meydanaörneğin kirpi yolunun sadece epidermis. Diğer sinyal olayları dermis ve epidermis 3 arasında gerçekleşecek. Örneğin, dermis Wnt sinyal saç folikülü gelişimi için önemli olduğu düşünülmektedir ve bunlar etkinleştirmek için anajen başlangıcında dermal papilla tarafından salgılanan saç folikülü çıkıntı kök / progenitör hücre çoğalması ve saç folikülü büyüme 4.. Daha iyi böyle cilt kanseri gibi rejeneratif cilt hastalığında tedirgin olabilir nasıl anlamak için epidermal gelişim ve yenilenme kontrol hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir.
Bu makalede, bir C uzuv açıklanır U tüm montaj cilt hazırlıklarını açıklık ve konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte 3 boyutlu protein ekspresyonu görselleştirmek için B yağmur ben maging kokteyller ve C omputational analiz (CUBIC) protokolünü 5-7 nobstructed. Kübik yöntemi cilt daldırma içerirİki aminoalkol bazlı kimyasal kokteyller doku. Bu çözümler tek bir hücre çözünürlükte immunodeteksiyon izin şeffaf ve proteinler sağlam dokuyu bırakarak, cilt numunede kırılma indeksleri ayarlayın.
interfolliküler epidermis ve saç folikülü keratinosit popülasyonları Böylece kübik protokolü, bazal kullanarak ve prolifere olan, anti-Keratin14 (K14) ve anti-Ki 67 antikorları kullanılarak vahşi tip farelerde tam kalınlıkta deri biyopsi görüntülenmiştir. wild tip cilt biyopsilerinde yağ bezleri de Nil Kırmızı boyama kullanılarak görüntülendi. Son olarak, vahşi tip ve hiperplastik YAP2-5SA-ΔC cilt biyopsilerinde bazal keratinosit popülasyonları 8 karşılaştırıldı.
Bu KÜBİK protokol tek hücre çözünürlükte tam kalınlıkta deri biyopsi protein ifadesinin görsel değerlendirmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş deride epidermal anatomi ve morfolojik kusurları takdir önemli bir araçtırfareler ve epidermal geliştirme ve yenilenme altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için.
Protocol
Representative Results
Discussion
cilt gelişimini ve homeostazisini kontrol eden düzenleyici mekanizmalar en yaygın cilt morfolojisi, hücre popülasyonlarının veya protein ifadesi sadece sınırlı bir takdir sağlayan antikorlar ile doku bölümlendirilmeleri ve histolojik boyama veya etiketleme kullanarak 2D çalışılmıştır. Bir dizi yöntem epidermal bütün bağlar 10-13 3 boyutlu tek hücre çözünürlükte hücre ve proteinlerin mekansal organizasyon görselleştirme artırmak için geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz hayvan deney ile destek için Avustralya Bio-Kaynaklar (Garvan Enstitüsü, Avustralya), Biyolojik Kaynaklar Merkezi (UNSW Avustralya) ve Hayvan Bakım ve Etik Komitesi teşekkür ederim. Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (Proje Hibe APP1062720) tarafından desteklenmiştir. Dr. Cesar P. Canales bir CONICYT-Becas Şili bursu (# 72101076) alıcıları olduğunu. Sayın Bassem Akladios UNSW Avustralya tarafından Üniversitesi Uluslararası Lisansüstü Ödülü bir alıcı.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
