Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount
Summary
Este informe describe un protocolo cúbico a aclarar las biopsias de espesor completo de piel de ratón, y visualizar los patrones de expresión de proteínas, células proliferantes, y sebocitos en la resolución de una sola célula en 3D. Este método permite una evaluación precisa de la anatomía y la patología de la piel y de los fenotipos anormales en la epidermis líneas de ratones modificados genéticamente.
Abstract
La piel es esencial para nuestra supervivencia. La capa externa de la epidermis se compone de la epidermis interfollicular, que es un epitelio escamoso estratificado que cubre la mayor parte de nuestro cuerpo, y anejos epidérmicos tales como los folículos pilosos y glándulas sudoríparas. La epidermis se somete a la regeneración de toda la vida y en respuesta a una lesión. Esto es posible gracias K14-expresión de poblaciones / células progenitoras madre epidérmicas basales que están fuertemente regulados por múltiples mecanismos reguladores activos dentro de la epidermis y entre la epidermis y la dermis. Este artículo describe un método simple para aclarar biopsias de espesor completo de ratón de la piel, y visualizar los patrones de expresión de proteínas K14, Ki67 etiquetados células en proliferación, Nile Red etiquetado sebocitos, y el etiquetado nuclear DAPI a una resolución de una sola célula en 3D. Este método permite una evaluación precisa y cuantificación de la anatomía y la patología de la piel y de los fenotipos anormales en la epidermis líneas de ratones modificados genéticamente. El protocolo cúbico es THe mejor método disponible hasta la fecha para investigar las interacciones moleculares y celulares en las biopsias de piel humana a una resolución de una sola célula.
Introduction
La piel es esencial para nuestra supervivencia. Se compone de tres capas principales la epidermis externa, la dermis y la hipodermis. La epidermis es un tejido altamente regenerativa. Es un epitelio escamoso estratificado, que consiste principalmente de los queratinocitos. Los queratinocitos nacen en la capa basal, y se mueven hacia arriba a través de las capas suprabasal vez que se diferencian, y, finalmente, que se desprenden de la capa córnea exterior alrededor de un mes después de su nacimiento. La epidermis se desarrolla una serie de apéndices incluyendo los folículos pilosos y las glándulas sebáceas. Los folículos pilosos también se regeneran de manera cíclica a lo largo de la vida 1. La capacidad de regeneración de la epidermis está activado por la presencia de células madre y progenitoras que se encuentran en la capa basal de la epidermis interfolicular y folículo piloso 2.
Muchas vías de señalización han sido implicados en el desarrollo epidérmico y la regeneración. Algunas de ellas tienen lugar dentro desólo la epidermis, tales como la vía de hedgehog. Otros eventos de señalización tienen lugar entre dermis y la epidermis 3. Por ejemplo, se cree que las señales de Wnt de la dermis que es importante para el desarrollo del folículo del cabello, y que son secretadas por la papila dérmica en el inicio de la fase anágena para activar la proliferación de células madre / progenitoras folículo piloso bulto y crecimiento del folículo piloso 4. Es importante comprender los mecanismos celulares y moleculares que controlan el desarrollo y la regeneración de la epidermis para comprender mejor la forma en que pueden ser perturbados en la enfermedad de la piel regenerativo como el cáncer de piel.
En este artículo se describe un Lear C, T nobstructed B cócteles Maging lluvia I y análisis omputational protocolo (cúbico) C 5-7 para aclarar preparaciones para la piel todo el montaje, y visualizar los patrones de expresión de proteínas en 3 dimensiones con una resolución única célula mediante microscopía confocal. El método CUBIC implica la inmersión de la pieltejido en dos cócteles químicos a base de aminoalcohol. Estas soluciones se ajustan los índices de refracción en la muestra de piel, dejando el tejido transparente y las proteínas intactas, permitiendo la inmunodetección con una resolución de una sola célula.
El uso de este protocolo cúbico, la basal y la proliferación de poblaciones de queratinocitos en la epidermis interfolicular y en el folículo piloso se obtuvieron imágenes en biopsias completos de ratones de tipo salvaje utilizando anti-Keratin14 (K14) y anticuerpos anti-Ki67 de piel de espesor. glándulas sebáceas en biopsias de piel de tipo salvaje también se visualizaron mediante tinción con Rojo Nilo. Por último, las poblaciones de queratinocitos basales en wildtype y biopsias de piel YAP2-5SA-? C hiperplásicos se compararon 8.
Este protocolo permite CÚBICO evaluación visual de la expresión de la proteína en las biopsias de piel de espesor total en la resolución de una sola célula, y es una herramienta importante tener en cuenta la anatomía de la epidermis y defectos morfológicos en la piel de organismos genéticamente modificadosratones, y para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen en el desarrollo y la regeneración epidérmica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los mecanismos de regulación que controlan el desarrollo y la homeostasis de la piel se estudian con más frecuencia en 2D usando seccionar los tejidos y la tinción histológica o etiquetado con anticuerpos, que permite solamente una apreciación restringido de la morfología de la piel, las poblaciones de células o la expresión de proteínas. Una serie de métodos se han desarrollado para mejorar la visualización de la organización espacial de las células y las proteínas con una resolución de una sola célula …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Australia Bio-Recursos (Instituto Garvan, Australia), el Centro de Recursos Biológicos (UNSW Australia) y el Cuidado de Animales y Comité de Ética para la ayuda con la experimentación animal. Este trabajo fue apoyado por la Salud y medicina Consejo Nacional de Investigación de Australia (Proyecto de Grant APP1062720). Dr. César P. Canales es beneficiarios de una beca CONICYT-Becas Chile (# 72101076). Bassem Akladios es un recipiente del Premio Internacional de Posgrado de la Universidad de UNSW Australia.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
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