פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T
Summary
In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Abstract
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
Introduction
המעי הוא השטח הגדול ביותר של הגוף, כי הוא חשוף לסביבה החיצונית. מערכים מכריעים של חיידקי תושב ליישב את המעי האנושי כדי ליצור את החיידקים במעי (או microflora). זה מוערך להכיל עד 100 טריליון תאים מיקרוביאליים ומהווה אחד בתי הגידול החיידקים הצפופים ביותר הידוע בביולוגיה 1-3. ב GIT חיידקים ליישב נישה המעי שבו הם לשרוד ולהתרבות 4. בתמורה, החיידקים מעניקים מארח עם תכונות פונקציונליות נוספות לא מקודדות על הגנום שלו 1. לדוגמא החיידקים ממגרים את השגשוג של תאי אפיתל, מייצרים ויטמינים שמארח לא יכול לייצר בעצמם, המווסתים את חילוף חומרים ומגנים מפני פתוגנים 4-6. בהינתן יחסים מועילים זו, חלק מהחברים הציעו כי בני אדם הם "סופר-אורגניזמים" או "holobionts" כי הם תערובת של גני חיידקי אדם 7,8. לאור ההשפעה המיטיבה של החיידקים על המארח (אדם), מערכת החיסון במעי צריך לסבול חיידקים commensal לאפשר קיומם לומן אלא גם להרוג את הפתוגנים לפלוש מצד לומינל 9-11. המערכת החיסונית של המעי פיתחה מנגנונים להבחין בין מזיק מזיקים חיידקים לומינל; אולם המנגנונים האלה עדיין אינם מובנים היטב 12. שמירה על שלמות מעיים דורשת הומאוסטזיס חיסוני מוסדר בחוזקה כדי לשמור על האיזון בין הסובלנות חסינה 13. חוסר איזון הומאוסטזיס חיסון תורם לזירוז של מחלות מעיים כמו מחלות מעי דלקתיות (IBD) 3,14.
ישנם שני סוגים עיקריים של IBD: מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC). חולים עם מחלות אלו בדרך כלל סובלים דימום רקטלי, לשלשולים חריפים וכאבי בטן 15,16. הגורם היחיד של IBD עדייןלא ידוע, אלא שילוב של גורמים גנטיים, השפעות סביבתיות תגובות חיסוניות dysregulated עשוי להיות האירוע המרכזי לפיתוח מחלה 15.
במודלים של בעלי חיים עבור IBD שימשו במשך למעלה מ -50 שנה. בעשורים האחרונים מערכות הדגם החדש IBD פותחו כדי לבדוק את השערות שונות בנוגע בפתוגנזה של IBD 17,18. המודל הטוב ביותר המאופיין של קוליטיס כרוני הוא המודל המדבק התא שגורם שיבוש הומאוסטזיס T-cell 19,20. מודל זה כרוך בהעברת תאי T נאיביים מעכברי immunocompetent לתוך מארחים חסרי T ו- B-תאי (כגון RAG – / – ועכברי SCID) 16,21. התפתחות המחלה במודל זה קיים מעקב על 3-10 שבועות על ידי הערכת נוכחות של שלשול, פעילות גופנית מופחתת, וירידה במשקל הגוף. זה מה שנקרא תסמונת לבזבז 16. לעומת העכברים הבריאים הרקמה גסת צבאות מושתלים היא Thicker, קצר וכבד 16. שימוש במודל העברת תאי T, אפשר להבין עד כמה שונה אוכלוסיות תאי T יכולות לתרום בפתוגנזה של IBD 22. המודל העברת תאי T אינו מנתח את יחסי הגומלין בין נגמ"שים ותאי T בתהליך המחלה בצורה אנטיגן ספציפי. הוכח כי אינטראקציה בין תאי מיאלואידית ותאי הלימפה יכולה להיות אחראית על הפיתוח של דלקת מעי 23. אף שהיבטים רבים של IBD הובהרו, האירועים הראשוניים להוביל להתפתחות המחלה עדיין צריכים להיות מובנים באופן ברור.
הוכח כי בהעדר קוליטיס העברת חיידקים לא ניתן להקים 24. לאחרונה, מספר תאוריות מראות כי IBD יכול להיות תוצאה של תגובה חיסונית נגד חיידקי commensal 25. גם מחברים הציעו כי חיידקים commensal חיוניים כדי לגרום דלקת במעי דיסטלי26. בשנת נבט חינם (GF) חיות מערכת החיסון במעי נפגעת בדרך כלל 27,28, אבל קולוניזציה של עכברים אלה בתערובת של תוצאות חיידקים ללא ספציפיים לפתוגן בפיתוח של מערכת החיסון במעי המוסמכת מלא 29. לפיכך, החיידקים נראה שיש מרכיב מפתח בפתוגנזה של IBD, או כמנגנון כי גוזר או מגינה מפני התפתחות של דלקת מעיים 30,31. התיאוריות נוכחיות מראות כי IBD היא תוצאה של חוסר איזון מיקרוביאלי, שנקרא dysbiosis, בחולי נטייה גנטית 32, אבל זה לא ברור עדיין אם dysbiosis הוא הגורם או התוצאה של המחלה 12. בהתחשב בתפקיד של מיקרואורגניזמים בפיתוח IBD, בניסויים במבחנה הראו כי תאי T מסוג CD4 + יכול להיות מופעל על ידי נגמ"שים פעמו עם חיידקים במעיים 33,34.
יתר על כן, הוכח כי אנטיגנים ממינים של חיידקים שונים commensal, כגון E. coli, Bacteroides, Eubacterium ו פרוטאוס, מסוגל להפעיל תאים מסוג CD4 + T 35. זה מצביע על כך הצגת אנטיגנים חיידקיים לתאי T. הוא בעל חשיבות לפיתוח IBD. כדי להפחית את המורכבות של אנטיגנים מרובים שמפיקים מיקרופלורת בתהליך המחלה, זן E.coli נוצר שמייצר את אנטיגן OVA. קוליטיס ההעברה הושר על ידי הזרקת תאי T OVA הספציפיים לתוך RAG – / – חיות יישב עם להביע OVA E. coli.
מודל זה מבוסס על ראיות שנעשו לאחרונה והראו כי CX 3 CR1 + חברי פרלמנט, קבוצת משנה תא מרכזי שכבת הרירית המיוחדת הגסה (CLP) 36, נמצאים באינטראקציה עם תאי CD4 + T במהלך העברת קוליטיס 37. חברי פרלמנט לדגום את חלל המעי לאנטיגן חלקיקים, כגון חיידקים, באמצעות הדנדריטים שלהם 36, 38,39. לימודים קודמיםהוכיחו כי חברי פרלמנט יכול גם לקחת את אנטיגנים מסיסים, כגון OVA, מוחדר המעי לומן 40,41. בהתחשב שפע של חברי פרלמנט CX 3 CR1 + ב CLP, יתכן כי תאים אלה יכולים לטעום חיידקים לומינל ולתקשר עם תאים מסוג CD4 T. הדמיה Confocal של עכברים מושתלים עם תאי OVA ספציפי CD4 + T יישבו עם E. coli CFP-OVA, מראים כי CX 3 CR1 + חברי פרלמנט נמצאים בקשר עם OT-II CD4 + T תאים במהלך התפתחות קוליטיס מונחה אנטיגן. מודל זה מאפשר לימוד של תהליך מצגת אנטיגן בין נגמ"שים מעיים T תאים ספציפיים רק לחיידקים להביע אנטיגן מסוים לומן המעי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמו בכל מודל אחר, מודל קוליטיס מונחה אנטיגן שתואר לעיל רשאי להציג כמה בעיות שחוקר ביצוע הטכניקה חייב להיות מודע. כאשר הזרקת OT-II / אדום + CD4 + T CD62L + התאים המארחים, החוקר חייב להיות מאוד עדין וזהיר להכניס את המחט לתוך חלל הצפק. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
Materials
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
- Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
- Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
- Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
- Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
- Sleator, R. D. The human superorganism – of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
- Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
- Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe?. World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
- Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
- Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, E86-E93 (2010).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
- Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
- Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
- Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
- Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
- Barnett, M., Fraser, A., O’Connor, M. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis – Treatments, Special Populations and the Future. , (2011).
- Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
- Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
- Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
- Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
- Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
- Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
- Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
- van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
- Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
- Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
- Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
- Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
- Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
- Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
- Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
- Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
- Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
- Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
- Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
- Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
- Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer’s patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
- Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
- Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
- Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
- Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
- Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
- Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
- Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).
