Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T
Summary
In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Abstract
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
Introduction
El intestino es la mayor superficie del cuerpo que está expuesta al ambiente externo. matrices extensas de microbios residentes colonizan el intestino humano para formar la microbiota intestinal (o microflora). Se estima que esto constar de hasta 100 billones de células microbianas y constituye uno de los hábitats bacterianas más densamente poblados conocidos en la biología 1-3. En el GIT bacterias colonizan un nicho intestinal donde sobreviven y se multiplican 4. A cambio, la microbiota dota a la máquina con características funcionales adicionales no codificadas en su genoma 1. Por ejemplo, la microbiota estimula la proliferación de las células epiteliales, produce vitaminas que alberga no puede producir por sí mismos, regula el metabolismo y protege contra patógenos 4-6. Dada esta relación beneficiosa, algunos autores han sugerido que los humanos son "súper-organismos" o "holobionts" que son una mezcla de genes bacterianos y humanos 7,8. Dado el impacto beneficioso de la microbiota en el host (humana), el sistema inmune intestinal necesita para tolerar los microbios comensales para permitir su existencia en la luz, sino también matar a los patógenos que invaden desde el lado luminal 9-11. El sistema inmune intestinal ha desarrollado mecanismos para distinguir entre los microbios inofensivos luminales y potencialmente dañinos; sin embargo, estos mecanismos no están todavía bien entendidas 12. El mantenimiento de la integridad intestinal requiere una homeostasis inmune estrechamente regulado para mantener el equilibrio entre la tolerancia y la inmunidad 13. Un desequilibrio en la homeostasis inmune contribuye a la inducción de enfermedades intestinales tales como la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) 3,14.
Hay dos tipos principales de IBD: la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (UC). Los pacientes con estas enfermedades por lo general sufren de sangrado rectal, diarrea y dolor abdominal 15,16. La causa de la EII es todavíadesconocido, pero una combinación de factores genéticos, factores ambientales y las respuestas inmunes dysregulated podría ser el evento clave para el desarrollo de la enfermedad 15.
Los modelos animales de EII se han utilizado durante más de 50 años. En las últimas décadas nuevos sistemas modelo de EII se han desarrollado para probar las diversas hipótesis relativa a la patogénesis de la EII 17,18. El modelo mejor caracterizado de colitis crónica es el modelo de transferencia de células T que induce la interrupción de la homeostasis de células T 19,20. Este modelo implica la transferencia de células T vírgenes de ratones inmunocompetentes en huéspedes que carecen de T y células B (como RAG – / – y ratones SCID) 16,21. El desarrollo de la enfermedad en este modelo se supervisa durante 3-10 semanas mediante la evaluación de la presencia de diarrea, la reducción de la actividad física, y la pérdida de peso corporal. Esto se llama así el síndrome de desgaste 16. En comparación con los ratones sano el tejido del colon de los ejércitos trasplantados es Thicker, más corto y más pesado 16. Usando el modelo de transferencia de células T, es posible comprender cómo los diferentes poblaciones de células T pueden contribuir a la patogénesis de la EII 22. El modelo de transferencia de células T no analiza las interacciones entre APCs y células T en el proceso de la enfermedad de una manera específica de antígeno. Se ha demostrado que la interacción entre las células mieloides y células linfoides podría ser responsable del desarrollo de la inflamación intestinal 23. Aunque no se han aclarado muchos aspectos de la EII, los eventos iniciales que conducen al desarrollo de la enfermedad todavía tienen que ser claramente entendido.
Se ha demostrado que, en ausencia de colitis transferencia microbiota no se puede establecer 24. Recientemente, varias teorías sugieren que la EII podría ser el resultado de una respuesta inmunitaria contra bacterias comensales 25. también han propuesto Autores que las bacterias comensales son esenciales para inducir la inflamación en el intestino distal26. En libre de gérmenes (GF), los animales del sistema inmunitario intestinal es generalmente deteriorada 27,28, pero una colonización de estos ratones con una mezcla de específico libres de patógenos bacterias resultados en el desarrollo del sistema inmunitario intestinal totalmente competente 29. Por lo tanto, la microbiota parece ser un elemento clave en la patogénesis de la EII, ya sea como un mecanismo que predispone a o protege contra el desarrollo de la inflamación intestinal 30,31. Las teorías actuales sugieren que la EII es el resultado de un desequilibrio microbiano, llamada disbiosis, en pacientes predispuestos genéticamente 32, pero no es claro aún si el disbiosis es la causa o la consecuencia de la enfermedad 12. Teniendo en cuenta el papel de los microorganismos en el desarrollo de la EII, en experimentos in vitro mostraron que las células T CD4 + se pueden activar por APCs pulsadas con bacterias intestinales 33,34.
Por otra parte, se ha demostrado que los antígenos dediferentes especies de bacterias comensales, tales como E. coli, Bacteroides, Eubacterium y Proteus, son capaces de activar células T CD4 + 35. Esto indica que la presentación de antígenos bacterianos a las células T es de importancia para el desarrollo de la EII. Para reducir la complejidad de múltiples antígenos derivados por la microflora en el proceso de la enfermedad, una cepa de E. coli ha sido creado que produce el antígeno OVA. La colitis transferencia fue inducida por la inyección de células T específicos de OVA en RAG – / – animales colonizados con OVA-expresión de E. coli.
Este modelo se basa en la evidencia reciente sugiere que la CX 3 CR1 + parlamentarios, un subconjunto de células importante en la lámina propia del colon (CLP) 36, están interactuando con las células T CD4 + durante la transferencia de la colitis 37. Los diputados de la muestra La luz intestinal para el antígeno de partículas, tales como bacterias, utilizando sus dendritas 36, 38,39. Estudios previosdemostró que los parlamentarios también puede tomar hasta antígenos solubles, tales como OVA, introducidos en el lumen intestinal 40,41. Dada la abundancia de CX 3 CR1 + parlamentarios en el CLP, es posible que estas células pueden degustar las bacterias luminales e interactuar con las células T CD4. Confocal de imágenes de los ratones trasplantados con células T CD4 + específicos de OVA colonizados con E. coli CFP-OVA, muestran que CX 3 CR1 + MPs están en contacto con las células OT-II T CD4 + durante el desarrollo de colitis antígeno impulsado. Este modelo permite el estudio del proceso de la presentación del antígeno entre APCs intestinales y células T específicas únicamente para determinados bacterias que expresan el antígeno en la luz intestinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al igual que con cualquier otro modelo, el modelo de colitis antígeno impulsado descrito anteriormente puede presentar algunos problemas que el investigador realiza la técnica debe tener en cuenta. Cuando se inyecta el AT-II / rojo + T CD4 + CD62L + células en los ejércitos, el investigador debe ser muy suave y cuidado de insertar la aguja en la cavidad peritoneal. El no hacerlo puede resultar en el desgarramiento del intestino del ratón, que podría conducir a la muerte, o una admi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
Materials
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan |
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