T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発
Summary
In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Abstract
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
Introduction
腸は、外部環境にさらされる体の最大の表面です。常駐微生物の広大な配列は、腸内細菌叢（または微生物叢）を形成するために、ヒトの腸にコロニーを形成します。これは、最大100000000000000微生物細胞からなると推定され、生物学1-3で知られている最も人口密度の高い細菌の生息地の1を構成しています。 GITでは細菌は、彼らが生き残ると4を掛け腸のニッチを植民地化。リターンでは、微生物は、そのゲノム1でエンコードされていない追加の機能的特徴を持つホストを付与します。例えば、微生物は、上皮細胞の増殖を刺激し、ホストは自分で作り出すことができないビタミンを生成し、代謝を調節し、病原体4-6から保護します。この有益な関係を考えると、いくつかの著者は、人間が「超生物」または細菌とヒト遺伝子7,8のミックスである「holobionts」であることを示唆しています。 （人間の）ホスト上の微生物叢の有益な影響を考えると、腸管免疫系はルーメンでその存在を可能にするだけでなく、腔側9-11から侵入する病原体を殺すために共生微生物を容認する必要があります。腸管免疫系は無害と潜在的に有害な管腔の微生物を区別するためのメカニズムを開発しました。しかし、これらのメカニズムはまだよく12を理解されていません。腸の整合性を維持することは寛容と免疫の13の間のバランスを保つために厳密に調節免疫恒常性を必要とします。免疫恒常性のアンバランスは、炎症性腸疾患（IBD）3,14などの腸疾患の誘導に寄与する。
クローン病（CD）および潰瘍性大腸炎（UC）：IBDの2つの主要なタイプがあります。これらの疾患を有する患者は、通常、直腸出血、重度の下痢や腹痛15,16苦しみます。 IBDの一つの原因はまだです不明ですが、遺伝的要因の組み合わせ、環境の影響および調節不全免疫応答が疾患の発症15のための重要な事象であるかもしれません。
IBDの動物モデルは、50年以上にわたって使用されてきました。過去数十年間、新しいIBDモデル系は、IBD 17,18の病因に関するさまざまな仮説をテストするために開発されてきました。慢性大腸炎の最もよく特徴付けられたモデルは、T細胞ホメオスタシス19,20の破壊を誘導し、T細胞移入モデルです。 16,21このモデルは、（ – / –およびSCIDマウスのようなRAGなど）TおよびB細胞を欠いている宿主に免疫したマウスからのナイーブT細胞を転送することを含みます。このモデルにおける疾患の発症は、下痢の存在を評価することによって、3-10週間モニター身体活動の減少、及び体重減少です。これには、消耗症候群16と呼ばれています。健康なマウスと比較して移植したホストの大腸組織は、シックですR、16短いと重いです。 T細胞移入モデルを使用して、T細胞集団は、IBD 22の病因に寄与することができる方法の異なる理解することが可能です。 T細胞移入モデルでは、抗原特異的様式で疾患プロセスにおけるAPCおよびT細胞の間の相互作用を分析しません。骨髄細胞およびリンパ系細胞間の相互作用は、腸の炎症23の発症の原因であることが示されています。 IBDの多くの側面が明らかにされてきたが、病気の開発につながる初期のイベントは、まだ明確に理解する必要があります。
微生物転写大腸炎の非存在下で24を確立できないことが示されています。最近、いくつかの説は、IBDは、共生細菌25に対する免疫応答の結果であることを示唆しています。著者らは、共生細菌は、遠位腸内の炎症を誘導するのに不可欠であることも提案しています26。生殖無料（GF）動物では腸管免疫系は、一般的に27,28を低下しているが、完全に有能な腸管免疫系29の開発における特定の病原体を含まない細菌の結果の混合物とこれらのマウスの植民地化。したがって、微生物叢は、いずれかの素因または腸の炎症30,31の開発から保護するメカニズムとして、IBDの病因における重要な要素であると思われます。現在の理論は、遺伝的素因の患者32に、IBDは、腸内毒素症と呼ばれる、微生物の不均衡の結果であることを示唆しているが、それは明らかではないが、まだ腸内毒素症は、原因や病気12の結果である場合。 IBDの発症における微生物の役割を考慮すると、 インビトロ実験において CD4 + T細胞は、腸内細菌33,34でパルスしたAPCにより活性化することができることを示しました。
また、より抗原ことが示されています例えば、Eなど、さまざまな共生細菌種、 大腸菌、バクテロイデス、ユーバクテリウムおよびプロテウスは 、CD4 + T細胞35を活性化することができます。これは、T細胞への細菌抗原の提示は、IBDの開発のために重要であることを示しています。疾患過程における微生物叢によって誘導される複数の抗原の複雑さを軽減するために、 大腸菌株は、OVA抗原を産生するように作成されています。転写性大腸炎は、RAGにOVA特異的T細胞を注射することによって誘導した– / – OVAを発現する大腸菌を保菌動物大腸菌 。
このモデルは、CX 3 CR1 +議員、結腸粘膜固有層（CLP）36の主要な細胞サブセットは、転送37を大腸炎の間にCD4 + T細胞と相互作用していることを示唆している最近の証拠に基づいています。国会議員は、その樹状突起36、38,39を使用して、細菌のような、粒子状抗原のための腸管腔をサンプリング。以前の研究国会議員はまた、腸管腔40,41に導入され、このようなOVAなどの可溶性抗原を、取ることができることを実証しました。 CLPにおけるCX 3 CR1 + MPの存在量を考えると、これらの細胞が管腔細菌をサンプリングし、CD4 T細胞と相互作用することが可能です。 E.が定着OVA特異的CD4 + T細胞を移植したマウスの共焦点イメージングコリ CFP-OVAは、CX 3 CR1 + MPSは抗原駆動型大腸炎の開発中OT-II CD4 + T細胞と接触していることを示しています。このモデルは、腸のAPCおよび唯一の腸管内腔における特定の抗原を発現する細菌に特異的なT細胞間の抗原提示プロセスの研究を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
他のすべてのモデルと同様に、上記の抗原駆動型大腸炎モデルは、技術を実行研究者が知っておく必要がありますいくつかの問題を提示することができます。 OT-IIホストで/レッド+ CD4 + T CD62L +細胞を注入すると、研究者は腹腔内に注射針を挿入することは非常に穏やかで注意しなければなりません。これを怠ると、死亡につながる可能性がマウスの腸、または任意の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
Materials
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan |
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