התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i> E. coli</i> באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא
Summary
We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Abstract
מכשולים המצויים על גבי ה- DNA, כוללים חלבונים בחוזקה נכנס ונגעים שונים, יכולים לעכב את ההתקדמות קשה של השכפול של התא. ההשתהות של replisome יכולה להוביל את ניתוק מן כרומוזום, או באופן חלקי או בשלמותו, מובילה לקריסה של המזלג שכפול. ההתאוששות מקריסה זו היא הכרח עבור התא שכפול כרומוזומליות מלא במדויק ולאחר מכן לחלק. לכן, כאשר הקריסה מתרחשת, התא התפתח מנגנונים מגוונים המתרחשים לשחזר את מזלג DNA ולאפשר שכפול להסתיים עם איכות גבוהה. בעבר, מסלולי תיקון שכפול אלה בחיידקים נחקרו באמצעות נזק UV, אשר יש לו את החיסרון של לא להיות מקומי לאתר ידוע. כתב יד זה מתאר מערכת ניצול מערכת מפעיל הקרינה מדכא (FROS) כדי ליצור בלוק חלבון מסוים באתר שיכולים לגרום השתהות וקריסה של שכפול FOrks ב coli Escherichia. פרט הפרוטוקולים כיצד מצב של שכפול ניתן דמיינו תאים בודדים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ביניים DNA שכפול יכול להיות מנותח על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose 2-ממדי. מוטציות טמפרטורה רגישות של רכיבי replisome (למשל DnaBts) יכולות להיות משולבות לתוך המערכת כדי לגרום לקריסה סינכרוני של המזלגות שכפול. יתר על כן, את התפקידים של חלבונים רקומבינציה helicases כי הם מעורבים בתהליכים אלה ניתן ללמוד באמצעות knockouts הגנטי בתוך מערכת זו.
Introduction
במהלך שכפול ה- DNA, replisome פונה מכשולים על DNA הפוגע בהתנהלותה. נזק לדנ"א כולל נגעים ופערים כמו גם מבנים סוטה יכול למנוע replisome מ שתמשיך 1. לאחרונה, זה כבר נמצא כי חלבונים מאוגדים ה- DNA הם המקור הנפוץ ביותר של מניעה שכפול התקדמות מזלג 2. הידע של אירועים בעקבות המפגש של replisome עם בלוק nucleoprotein הוגבל בעבר על ידי חוסר היכולת לגרום בלוק כזה כרומוזום של תא חי בבאתר ידוע. ניתוח במבחנה שיפרה את ההבנה שלנו של התנהגות קינטית של replisome פעיל כאשר הוא פוגש סתימה nucleoprotein 3, כמו גם את הפרטים מכניסטית של replisome עצמו 4,5. הבנה נוכחית של התיקון של שכפול נעשית בדרך כלל עם UV כסוכן המזיק ללמוד באמצעות פלסמיד דנ"א in vivo 6-8 </sעד>. בעוד החלבונים שעשויים להיות מעורב תיקון DNA לאחר היא נתקלת לחסום nucleoprotein vivo ב הם הבינו בדרך כלל ממחקרים אלה, אם ישנן וריאציות של האירועים המולקולריים בתוך מסלולי התיקון בשל הגורם הברור בבלוק שהכפול עדיין עדיין להיות נחוש.
כאן אנו מתארים מערכת המאפשרת לחסום nucleoprotein שיוקם במיקום ספציפי של כרומוזום באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכאת (FROS). אנו מנצלים זן של E. coli כי יש לו מערך של 240 אתרי TETO שולבו כרומוזום 9. כל אתר TETO בתוך המערך יש רצף אקראי 10 נ"ב איגוף זה כדי להגדיל את היציבות של המערך על ידי מניעת רקומבינציה בתיווך RecA בתוך המערך. מערך זה, ווריאציות של אותו, שימשו במקור להבין E. דינמיקת כרומוזום coli 10,11 אבל הותאמו ואז preveNT in vivo שכפול 12. המערך נמצא להישמר ביציבות לחסום קרוב ל -100% של מזלגות שכפול כאשר מחויב TetR 10,12. השימוש במערך Laco הדומה במבחנה מצא כמה כמו 22 אתרים היו מספיקים כדי לחסום 90% של שכפול, למרות מערך קצר זה היה פחות יעיל vivo 13. כדי להתאים את המערך ליצור סתימת nucleoprotein, החלבון המדכא חייב להיות overproduced מאוד בתנאי אופטימיזציה איפה זה אז נקשר המערך ליצור מחסום. היווצרות של חסימה, ולשחרר הבאים שלה, ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אם גרסה מתויג fluorescently של מדכא ט משמש. מעמדו של שכפול בכל תא מותווה במספר המוקדים לראות, שם נקודה אחת מוקדים אומר רק עותק אחד של המערך נמצא בתוך התא מוקדים מרובים מעידים על שכפול פעיל. מחדש אקטיבית זוקפול מופעלת כאשר חסימת nucleoprotein מתהפכת על ידי התוספת של inducer מיותר כי מקטין את הזיקה המחייבת של TetR עבור האתר מפעיל מספיק עבור replisome ולעבור את המערך. החלבון המדכא עדיין מסוגל להיקשר ל- DNA עם זיקה גבוהה מספיק כי העותקים עכשיו המרובים של המערך ניתן דמיינו.
עוד פרטים סבוכים של אירועי סתימת nucleoprotein יכולים להתגלות באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose ניטראלי ניטראלית דו ממדים ו כלת דרום 14-16. טכניקות אלו מאפשרים ניתוח של מבנים DNA על פני האוכלוסייה. ביניים שכפול אשר נוצרים במהלך האירוע, ואפשרות להישאר מתוקנים, ניתן דמיינו. על ידי שינוי אנזים ההגבלה ו ניצל חללי, את התשומות ניתן דמיינו לא רק באזור אלא גם מערך זרם של המערך כאשר המזלג שהכפול נסוג 17,18. הרגרסיה מתקיים לאחר ניתוק replisome; גדילי המתהווה המובילים מפגרים נפרדים מן גדילי התבנית לחשל זה לזה כמו גדילי תבנית במקביל מחדש לחשל וכתוצאה מכך מבנה ה- DNA ארבעה-כיווני (צומת הולידיי).
באמצעות מערכת זו הוכחה כי המזלג שהכפול אינו יציב כאשר הוא נתקל בלוק זה 18. בנוסף, נגזרים רגישים לטמפרטורה של רכיבי replisome יכולים להיות מנוצלים כדי למנוע העמסת יתר של המזלג שכפול פעם זה קרס. לאחר בלוק מוקם, הזן יכול להיות מוזז לטמפרטורה אוֹסְרָנִי כדי להבטיח שחרור משרות סינכרוני של replisome וכן מניעת מבוקרת של העמסת יתר. הטמפרטורה הנגרמת זה שחרור משרות מבטיחה כל המזלגות בתוך האוכלוסייה קרסו בזמן נתון ומאפשר הערכה של מה קורה כאשר replisome מתמוטט, כיצד DNA מעובד, ומה נדרש כדי מחדשלהתחיל בתהליך של שכפול ה- DNA.
אחד היתרונות של המערכת המתוארת כאן היא כי לחסום nucleoprotein הוא הפיך לחלוטין; ולכן, היכולת של התאים להתאושש מגוש nucleoprotein היא מסוגלת להיות אחריו. התוספת של anhydrotetracycline לתאי תקל על דוק מחייב של המדכא, המאפשרת מזלג שכפול ולעבור והתא להשיב כדאיות. ההקלה של סתימה ניתן דמיינו ידי נייטרלי נייטרלי דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה agarose לאחר 5 דק ', ועל ידי מיקרוסקופיה בתוך 10 דקות. יתר על כן, ניתוח כדאיות יכול לחשוף את היכולת של הזן להתאושש הסתימה שהכפולה ממשיך להתרבות.
על ידי שינוי הרקע הגנטי של הזנים המשמשים הליך הניסוי המתואר כאן, שמסלולי התיקון עבור סוג זה של חסימה ניתן הובהרו.
Protocol
Representative Results
Discussion
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Materials
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |
References
- Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
- Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).
- McGlynn, P., Guy, C. P. Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro. J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).
- Tanner, N. A., et al. Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).
- Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli. Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).
- Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli. Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).
- Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal. Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).
- Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves. Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).
- Lau, I. F., et al. Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes. Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).
- Gordon, G. S., et al. Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms. Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).
- Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo. EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).
- Payne, B. T., et al. Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
- Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli. Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).
- Mettrick, K. A., Grainge, I. Stability of blocked replication forks in vivo. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Church, G. M., Gilbert, W. Genomic sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).
- Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. Multiple pathways process stalled replication forks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).
- Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).
- Carl, P. L. Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA. Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).
- Nawotka, K. A., Huberman, J. A. Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons. Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).
- Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control. J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).
