Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение<i> E. палочки</i> Использование системы Люминесцентные репрессора оператора

Summary

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Препятствия, присутствующие на ДНК, в том числе плотно связанных белков и различных повреждений, может серьезно тормозят прогрессирование аппарата репликации клетки. Глохнет из replisome может привести к его диссоциации из хромосомы, либо частично или полностью, что приводит к коллапсу репликативной вилки. Восстановление после этого краха является необходимостью для клетки точно полное дублирование хромосомные и впоследствии разделить. Поэтому, когда происходит коллапс, клетка эволюционировала различные механизмы, которые имеют место, чтобы восстановить вилы ДНК и позволяют репликации должна быть завершена с высокой точностью. Ранее эти ремонтные репликации путей у бактерий были изучены с использованием УФ-повреждения, который имеет тот недостаток, что не локализованы в известном месте. Эта рукопись описывает систему с использованием системы флуоресценция репрессора оператора (FROS), чтобы создать сайт-специфический блок белка, который может вызвать пробуксовки и коллапс репликации FoRKS в кишечной палочки. Протоколы подробно рассматривается, как состояние репликации могут быть визуализированы в одиночных живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии и репликации ДНК промежуточных соединений могут быть проанализированы с помощью 2-мерного электрофореза в агарозном геле. Чувствительные к температуре мутанты replisome компонентов (например , DnaBts) могут быть включены в систему , чтобы вызвать синхронное коллапс вилок репликации. Кроме того, роль рекомбинации белков и геликаз, которые участвуют в этих процессах могут быть изучены с использованием генетических нокаутов в рамках этой системы.

Introduction

Во время репликации ДНК, то replisome сталкивается с препятствиями на ДНК, которые нарушают ее прогрессирование. Повреждение ДНК , включая поражений и пробелов, а также аномальным структуры могут помешать replisome от ¹ продолжить. В последнее время было обнаружено , что белки , которые связываются с ДНК , являются наиболее распространенным источником препятствий для репликации вилки прогрессии ^2. Знание событий после столкновение с replisome с нуклеопротеидной блока ранее было ограничено неспособностью вызвать такой блок в хромосоме живой клетки в известном месте. В пробирке анализ углубили наше понимание кинетического поведения активного replisome , когда он встречает нуклеопротеидную засорение ^3, а также механистические детали самого ^4,5 replisome. Современное понимание ремонта репликации , как правило , проводится с УФ в качестве повреждающего агента и исследовали с использованием плазмидной ДНК в естественных условиях ^6-8 </sвверх>. В то время как белки , которые могут быть вовлечены в восстановление ДНК после того, как он встречает нуклеопротеидную блок в естественных условиях , как правило , понятны из этих исследований, есть ли различия в молекулярных событий в пределах ремонтных путей вследствие отчетливой причины в блоке репликации до сих пор еще быть определенным.

Здесь мы описываем систему, которая позволяет нуклеопротеид блок, который будет создан в определенном месте хромосомы с использованием системы Fluorescent репрессора оператора (FROS). Мы используем штамм E. палочка, которая была массив 240 сайтов Teto включенных в хромосоме ^9. Каждый сайт Teto в массиве имеет 10 п.н. случайную последовательность фланкирующей это повышение устойчивости массива путем предотвращения RecA-опосредованной рекомбинации в пределах массива. Этот массив, и вариации этого, первоначально использовались , чтобы понять , E. динамика ^10,11 палочки хромосом , но затем были адаптированы к Превент в естественных условиях репликации ^12. Массив было установлено, стабильно поддерживаться и блокировать близка к 100% вилок репликации при связывании тетр ^10,12. Использование подобного массива Laco в пробирке нашел всего лишь 22 сайта было достаточно , чтобы блокировать 90% репликации, хотя этот короткий массив был менее эффективен в естественных условиях ^13. Для того, чтобы адаптировать массив для создания нуклеопротеидную засорение, белок репрессор должен быть сильно избыточном в оптимальных условиях, где она затем связывается с массива для создания контрольно-пропускной пункт. Формирование закупорки, и его последующее высвобождение, можно контролировать путем использования флуоресцентной микроскопии, если флуоресцентно меченый вариант репрессора Tet используется. Статус репликации в каждой ячейке указывается числом очагов видно, где один координационный центр означает только одна копия массива присутствует в клетке и множественные фокусы свидетельствуют о активной репликации. Это активное повторноепликация включается, когда нуклеопротеид закупорка восстанавливается добавлением безвозмездное индуктора, что уменьшает сродство связывания тетр для сайта оператора достаточно для replisome пройти через массив. Белок-репрессор по-прежнему способен связываться с ДНК с достаточно высоким сродством, которые могут быть визуализированы в настоящее множественные копии массива.

Более сложные детали событий на нуклеопротеидной закупорки могут быть обнаружены с помощью нейтрально-нейтрального двумерную электрофореза в агарозном геле и гибридизацию ^14-16. Эти методы позволяют анализировать структуры ДНК по всей популяции. Промежуточные репликации, которые образуются в ходе мероприятия, и потенциально остаются неотремонтированный, могут быть визуализированы. Изменяя фермента рестрикции и зонд разведения, промежуточные продукты могут быть визуализированы не только в области массива , но и выше по потоку от массива , когда вилка репликации регрессирует ^17,18.регрессия происходит вслед за replisome диссоциации; ведущие и отстающие зарождающиеся нити отдельно от нитей шаблонов и отжигу друг с другом в виде нитей шаблона по совместительству повторной отжигу, что приводит к структуре ДНК четырех направлениях (а Holliday соединения).

С помощью этой системы было показано , что вилка репликации не является стабильным , когда он сталкивается с этим блок ^18. Кроме того, чувствительные к температуре производные компонентов replisome могут быть использованы для предотвращения перегрузки репликативной вилки, как только она разрушилась. После того, как блок устанавливается, штамм может быть перенесен на непермиссивной температуры, чтобы обеспечить синхронное дезактивацию replisome и контролируемую предотвращение перезарядки. Эта температура индуцированной деактивация обеспечивает все вилами в популяции рухнули в данный момент времени и позволяет оценить то, что происходит, когда replisome рушится, как обрабатывается ДНК, и что требуется повторноначать процесс репликации ДНК.

Преимущество системы, описанной здесь, является то, что блок нуклеопротеид полностью обратимо; Таким образом, способность клеток восстанавливать из блока нуклеопротеидной способен следовать. Добавление anhydrotetracycline к клеткам разгрузит прочное связывание репрессора, что позволяет развилка репликации и пройти через клетку, чтобы восстановить жизнеспособность. Рельеф закупорки может быть визуализированы с помощью нейтрально-нейтрального двумерного электрофореза в агарозном геле после 5 мин, и с помощью микроскопии в течение 10 мин. Кроме того, анализ жизнеспособности может выявить способность штамма восстановиться после закупорки репликации и продолжают размножаться.

Путем изменения генетического фона штаммов, используемых в экспериментальной методике, описанной здесь, ремонт пути для этого типа закупорки может быть выяснена.

Protocol

1. Блокирование репликации с FROS Индуцируя репликации закупорки Разведите свежий ночной культуры в Е. штамм E.coli , несущий массив Teto и pKM1 от 18 до OD 600 нм = 0,01 в разбавленном комплексной среде (0,1% триптона, 0,05% дрожжевого экстракта, 0,1% NaCl, 0,17 М KH 2 PO 4,…

Representative Results

FROS является индуцибельной, сайт-специфический нуклеопротеид блок , который позволяет промежуточные продукты репликации для визуализации в живых клетках 12,18. Общий план эксперимента для отбора клеток показана на рисунке 1. Сроки отбора проб и вариаций г…

Discussion

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…

Materials

Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 x 300mm