Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in<i> E. coli</i> Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Summary

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Obstakels van DNA, met inbegrip strak gebonden eiwitten en verscheidene laesies, kan ernstig de progressie van de cel replicatieapparatuur remmen. De blokkering van een replisome kan leiden tot de dissociatie van het chromosoom, hetzij gedeeltelijk of volledig, wat leidt tot de ineenstorting van de replicatie vork. Het herstel van deze val is een noodzaak voor de cel nauwkeurig volledige chromosomale duplicatie en vervolgens verdelen. Daarom, wanneer de instorting optreedt, de cel geëvolueerd diverse mechanismen die plek om de DNA vork te herstellen en laat replicatie neem aan te vullen met high fidelity. Eerder zijn deze replicatie herstel pathways in bacteriën bestudeerd met behulp van UV-schade, die het nadeel van het niet gelokaliseerd op een bekende plaats heeft. Dit manuscript beschrijft een systeem met behulp van een fluorescentie-repressor Operator System (FROS) om een ​​site-specifiek eiwit blok dat de stalling en de ineenstorting van de replicatie fo kan induceren creërenrks in Escherichia coli. Protocollen detail hoe de status van replicatie kan worden gevisualiseerd in enkelvoudige levende cellen middels fluorescentiemicroscopie en DNA replicatie tussenproducten kunnen worden geanalyseerd door 2-dimensionale agarose gelelektroforese. Temperatuurgevoelige mutanten van replisome componenten (bijv DnaBts) kunnen in het systeem worden opgenomen om een synchrone ineenstorting van de replicatievorken induceren. Bovendien kan de rol van de recombinatie eiwitten en helicases die betrokken zijn bij deze processen worden onderzocht met behulp van genetische knockouts in dit systeem.

Introduction

Tijdens DNA-replicatie, de replisome geconfronteerd obstakels op het DNA die de progressie beïnvloeden. DNA-schade met inbegrip van letsels en hiaten evenals afwijkende structuren kunnen voorkomen dat de replisome voortzetting ^1. Recentelijk is gevonden dat eiwitten gebonden aan het DNA zijn de meest voorkomende bron van belemmering vork progressie ² replicatie. De kennis van de gebeurtenissen na de ontmoeting van de replisome met een nucleoproteïne blok eerder beperkt door het onvermogen om zo'n blok in het chromosoom van een levende cel te induceren op een bekende locatie. In vitro onderzoek heeft ons begrip van de kinetisch gedrag verbeterd een actieve replisome wanneer aan een nucleoproteïne blokkade ^3, alsmede de mechanische details van de replisome zelf ^4,5. Huidige kennis van de reparatie van replicatie wordt gewoonlijk uitgevoerd met UV als beschadigende middel en onderzocht met behulp van nucleïnezuren in vivo ^6-8 </sup>. Terwijl de eiwitten die betrokken kunnen zijn bij reparatie van DNA na het tegenkomt in vivo kerneiwitten blok algemeen verstaan ​​van deze onderzoeken of er verschillen in de moleculaire gebeurtenissen binnen de herstelmechanismen vanwege de duidelijke oorzaak van de replicatie blok blijft nog nader te bepalen.

We beschrijven hier een systeem waarmee een nucleoproteïne blok op een specifieke locatie van het chromosoom met behulp van een TL-repressor operatorsysteem (FROS) worden vastgesteld. Wij gebruiken een stam van E. coli die een reeks van 240 tetO-plaatsen opgenomen in het chromosoom ⁹ heeft. TetO elke plaats in de array een 10 bp willekeurige sequentie flankerende om de stabiliteit van de matrix te verhogen door het voorkomen RecA-gemedieerde recombinatie in de array. Deze array, en variaties daarvan, werden oorspronkelijk gebruikt om E. begrijpen coli chromosoom dynamiek ^10,11, maar werden vervolgens aangepast aan prevent in vivo replicatie ^12. De matrix is gevonden stabiel worden gehandhaafd en naar blok dicht bij 100% van replicatievorken wanneer gebonden TetR ^10,12. Het gebruik van de vergelijkbare lacO array in vitro is gevonden zo weinig als 22 plaatsen voldoende om 90% van replicatie geblokkeerd waren, hoewel kortere matrix minder effectief in vivo ¹³ was. De matrix aan te passen aan een nucleoproteïne verstopping maken dient de repressor eiwit zeer op overproductie onder geoptimaliseerde omstandigheden waar het dan bindt aan de array een wegversperring maken. De vorming van de blokkering en de daaropvolgende afgifte, kan worden gemonitord met behulp van fluorescentiemicroscopie of een fluorescent gelabeld variant van het Tet-repressor wordt gebruikt. De status van replicatie in elke cel wordt aangeduid door het aantal foci gezien, waarbij een enkel brandpunt betekent maar een kopie van de matrix aanwezig in de cel en meerdere foci zijn indicatief voor actieve replicatie. Deze actieve replicatie wordt ingeschakeld wanneer het nucleoproteïne blokkade wordt omgekeerd door de toevoeging van de inducer onnodig dat de bindingsaffiniteit van het TetR operatorplaats afneemt voldoende voor replisome te gaan door de matrix. De repressor proteïne nog kan binden aan het DNA met hoog genoeg affiniteit die de nu meerdere kopieën van de matrix kan worden gevisualiseerd.

Meer ingewikkelde details van de gebeurtenissen bij de nucleoproteïne blokkade kan worden ontdekt met behulp van neutrale-neutrale tweedimensionale agarosegelelektroforese en Southern hybridisatie ^14-16. Deze technieken laten de analyse van DNA tussen de diverse populatie. De replicatie tussenproducten die gevormd worden tijdens het evenement, en mogelijk nog niet herstelde, kan worden gevisualiseerd. Door het variëren van de restrictie-enzym en probe gebruikt, kunnen de tussenproducten worden gevisualiseerd niet alleen in de matrix gebied maar ook stroomopwaarts van de matrix bij de replicatievork regresses ^17,18. Deregressie heeft plaatsgevonden na de replisome dissociatie; de leidende en ontluikende strengen te scheiden van de template strengen en hybridiseren met elkaar als de matrijs strengen tegelijkertijd opnieuw gloeien resulteert in een vierweg DNA-structuur (a Holliday kruising).

Met dit systeem is aangetoond dat de replicatie vork niet stabiel wanneer dit blok ¹⁸ stuit. Daarnaast kunnen derivaten van temperatuurgevoelige replisome componenten worden gebruikt om te voorkomen dat het herladen van de replicatievork eenmaal is ingestort. Zodra een blok wordt ingesteld, kan de spanning worden verschoven naar een niet-permissieve temperatuur voor een synchrone deactivering van de replisome en een gecontroleerd preventie herladen waarborgen. Deze temperatuur veroorzaakte deactivering zorgt alle vorken binnen de populatie ingestort op een bepaalde tijd en maakt de beoordeling van wat gebeurt wanneer de replisome instort, hoe het DNA wordt verwerkt, wat nodig is om restart het proces van DNA-replicatie.

Een voordeel van het beschreven systeem is dat het nucleoproteïne blok is volledig omkeerbaar; Daarom werd het vermogen van de cellen om te herstellen van het nucleoproteïne blok kan volgen. De toevoeging van anhydrotetracycline aan de cellen zal verlichten de sterke binding van de repressor, waardoor een replicatie vork om door te gaan en de cel om de levensvatbaarheid te herwinnen. De verlichting van de blokkering kan worden gevisualiseerd door neutrale neutraal tweedimensionale agarosegelelektroforese na 5 min en met behulp van microscopie binnen 10 minuten. Bovendien kan levensvatbaarheid van het vermogen van de stam om van de replicatie blokkade en blijven prolifereren onthullen.

Door het veranderen van de genetische achtergrond van de stammen die in de experimentele hier beschreven, kan de herstelmechanismen voor dergelijke blokkade worden toegelicht.

Protocol

1. Het blokkeren van replicatie met FROS Induceren van de Replication Verstopping Verdun een frisse 's nachts cultuur van een E. coli stam die een tetO array en pKM1 18 OD 600 nm = 0,01 in een verdunde complex medium (0,1% trypton, 0,05% gistextract, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) met antibiotica behoefte voor selectie. Opmerking: Weet tetracycline niet toe te voegen voor de selectie, omdat he…

Representative Results

De FROS een induceerbare, plaatsspecifieke nucleoproteïne blok dat replicatie-intermediairen mogelijk maakt worden gevisualiseerd in levende cellen 12,18. Een algemene experimentele opzet voor het bemonsteren cellen wordt geïllustreerd in figuur 1. De timing van de bemonstering en verschillen in genetische achtergrond maken dit een veelzijdig systeem voor het bestuderen van het herstel van een dergelijk blok. Het schema illustreert hoe temperatuurgevoelige m…

Discussion

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…

Materials

Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 x 300mm