We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Forhindringer til stede på DNA, herunder fast-bundne proteiner og forskellige læsioner, kan alvorligt hæmme progressionen af cellens replikationsmaskineri. Den blokering af en replisome kan føre til sin afstandtagen fra kromosomet, enten delvist eller sin helhed, hvilket fører til sammenbrud af replikation gaffel. Opsvinget fra dette sammenbrud er en nødvendighed for cellen til præcist komplet kromosomal dobbeltarbejde og efterfølgende dele. Derfor, når kollapset sker, har cellen udviklet diverse mekanismer, der finder sted for at genoprette DNA gaffel og tillade replikering skal suppleres med high fidelity. Tidligere har disse replikation reparationsveje i bakterier blev undersøgt ved anvendelse af UV-skader, som har den ulempe ikke at blive lokaliseret til et kendt sted. Dette håndskrift beskriver et system udnytter en Fluorescence Repressor Operator System (Frøs) for at skabe et site-specifikt protein blok, der kan inducere stalling og sammenbrud replikation foRKS i Escherichia coli. Protokoller detaljer, hvordan status for replikation kan visualiseres i enkelte levende celler under anvendelse af fluorescens mikroskopi og DNA-replikationsmellemprodukter kan analyseres ved 2-dimensional agarosegelelektroforese. Temperaturfølsomme mutanter af replisome komponenter (f.eks DnaBts) kan inkorporeres i systemet for at inducere en synkron kollaps af replikationsgafler. Desuden kan roller rekombinationsproteiner og helicaser, der er involveret i disse processer studeres ved hjælp af genetiske knockouts i dette system.
Under DNA-replikation, den replisome vender forhindringer på DNA, der forringer dens progression. DNA-skader, herunder læsioner og huller samt afvigende strukturer kan forhindre replisome fra fortsætter en. For nylig har det vist sig, at proteiner bundet til DNA'et er den mest almindelige kilde til hindring for replikationsgaffel progression 2. Kendskabet til begivenhederne efter mødet af replisome med et nukleoprotein blok har tidligere været begrænset af den manglende evne til at inducere en sådan blok i kromosomet i en levende celle ved et kendt sted. In vitro analyse har forbedret vores forståelse af den kinetiske adfærd af en aktiv replisome når den møder en nukleoprotein blokering 3, samt de mekanistiske detaljer af selve 4,5 replisome. Nuværende forståelse af reparation af replikation er generelt foretages med UV som skadelige middel og undersøgt ved hjælp af plasmid-DNA in vivo 6-8 </sop>. Mens de proteiner, der kan være involveret i reparation af DNA efter den møder en in vivo nukleoprotein blok forstås generelt fra disse undersøgelser, om der er variationer i de molekylære begivenheder inden for reparation veje på grund af tydelig årsag i replikation blok stadig endnu mangler at blive afklaret.
Her beskriver vi et system, der tillader en nukleoprotein blok at være etableret i et bestemt sted på kromosomet ved hjælp af en fluorescerende Repressor Operator System (Frøs). Vi benytter en stamme af E. coli, som har haft et array af 240 tetO sites inkorporeret i kromosomet 9. Hver tetO sted inden i arrayet har en 10 bp tilfældig sekvens flankerende det at forøge stabiliteten af arrayet ved at forhindre RecA-medieret rekombination indenfor array'et. Dette array, og variationer af det, der oprindeligt blev brugt til at forstå E. coli kromosom dynamik 10,11 men blev derefter tilpasset Prevent in vivo-replikation 12. Grupperingen har vist sig at opretholdes stabilt og blokere tæt på 100% af replikationsgafler når bundet af TetR 10,12. Anvendelsen af den tilsvarende lacO arrayet in vitro har fundet så få som 22 steder var tilstrækkelig til at blokere 90% af replikation, selv om dette kortere matrix var mindre effektivt in vivo 13. For at tilpasse array til at skabe et nukleoprotein blokering, skal repressorproteinet være højt overproduceres under optimerede betingelser, hvor det derefter binder til arrayet for at skabe en vejspærring. Dannelsen af blokeringen, og dens efterfølgende frigivelse, kan overvåges ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, hvis der anvendes en fluorescens mærkede variant af Tet-repressoren. Status for replikation i hver celle er angivet ved antallet af foci set hvor en enkelt brændpunkt betyder kun én kopi af arrayet er til stede i cellen og multiple foci er tegn på aktiv replikation. Denne aktive redelsen aktiveres, når nukleoprotein blokering reverseres ved tilsætning af den umotiveret inducer der reducerer bindingsaffiniteten af TetR for operatøren stedet tilstrækkelig til replisome at fortsætte gennem arrayet. Repressorproteinet er stadig i stand til at binde til DNA med høj nok affinitet, at de nu flere kopier af arrayet kan visualiseres.
Mere indviklede detaljer i begivenhederne på nukleoprotein blokering kan opdages ved hjælp af neutral-neutral todimensional agarosegelelektroforese og Southern hybridisering 14-16. Disse teknikker gør det muligt at analysere DNA-strukturer i befolkningen. Replikation mellemprodukter, der dannes under arrangementet, og potentielt forblive udbedrede, kan visualiseres. Ved at variere restriktionsenzym og probe anvendes, kan mellemprodukterne visualiseres ikke kun i array region, men også opstrøms for grupperingen, når replikationsgaflen regredere 17,18. Detregression finder sted efter den replisome dissociation; de førende og tilbagestående nascente strenge adskilt fra templatestrengene og annealer til hinanden som templatestrengene samtidigt re-annealer resulterer i en fire-vejs DNA-struktur (a Holliday junction).
Anvendelse af dette system er det blevet vist, at replikationsgaflen er ikke stabilt, når det støder på denne blok 18. Desuden kan temperaturfølsomme derivater af replisome komponenter anvendes til at forhindre ladning af replikationsgaflen når den er brudt sammen. Når en blok er etableret, kan stammen forskydes til en ikke-permissiv temperatur for at sikre en synkron deaktivering af replisome og en kontrolleret forebyggelse af ladning. Denne temperatur-induceret deaktivering sikrer alle gaflerne i befolkningen er kollapset på et givet tidspunkt og gør det muligt at vurdere, hvad der sker, når replisome kollapser, hvordan DNA'et er behandlet, og hvad der kræves for at restarte processen af DNA-replikation.
En fordel ved den her beskrevne system er, at nukleoprotein blok er fuldt reversibel; derfor cellernes evne til at komme sig efter nukleoproteinet blok er i stand til at blive fulgt. Tilsætningen af anhydrotetracycline til cellerne vil aflaste tæt binding af repressoren, hvilket tillader en replikationsgaflen at fortsætte gennem og cellen at genvinde levedygtighed. Lindring af blokeringen kan visualiseres ved neutral-neutral todimensional agarosegelelektroforese efter 5 minutter, og ved mikroskopi inden for 10 min. Endvidere kan levedygtighed analyse afsløre Stammens evne til at komme sig efter replikation blokering og fortsætte med at formere sig.
Ved at ændre den genetiske baggrund af stammerne anvendt i den eksperimentelle fremgangsmåde beskrevet her, kan reparation veje for denne type blokering blive belyst.
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |