Inducerer en stedsspecifik Replication Blokering i<i> E. coli</i> Brug en Fluorescent Repressor Operator System

Summary

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Forhindringer til stede på DNA, herunder fast-bundne proteiner og forskellige læsioner, kan alvorligt hæmme progressionen af ​​cellens replikationsmaskineri. Den blokering af en replisome kan føre til sin afstandtagen fra kromosomet, enten delvist eller sin helhed, hvilket fører til sammenbrud af replikation gaffel. Opsvinget fra dette sammenbrud er en nødvendighed for cellen til præcist komplet kromosomal dobbeltarbejde og efterfølgende dele. Derfor, når kollapset sker, har cellen udviklet diverse mekanismer, der finder sted for at genoprette DNA gaffel og tillade replikering skal suppleres med high fidelity. Tidligere har disse replikation reparationsveje i bakterier blev undersøgt ved anvendelse af UV-skader, som har den ulempe ikke at blive lokaliseret til et kendt sted. Dette håndskrift beskriver et system udnytter en Fluorescence Repressor Operator System (Frøs) for at skabe et site-specifikt protein blok, der kan inducere stalling og sammenbrud replikation foRKS i Escherichia coli. Protokoller detaljer, hvordan status for replikation kan visualiseres i enkelte levende celler under anvendelse af fluorescens mikroskopi og DNA-replikationsmellemprodukter kan analyseres ved 2-dimensional agarosegelelektroforese. Temperaturfølsomme mutanter af replisome komponenter (f.eks DnaBts) kan inkorporeres i systemet for at inducere en synkron kollaps af replikationsgafler. Desuden kan roller rekombinationsproteiner og helicaser, der er involveret i disse processer studeres ved hjælp af genetiske knockouts i dette system.

Introduction

Under DNA-replikation, den replisome vender forhindringer på DNA, der forringer dens progression. DNA-skader, herunder læsioner og huller samt afvigende strukturer kan forhindre replisome fra fortsætter ^en. For nylig har det vist sig, at proteiner bundet til DNA'et er den mest almindelige kilde til hindring for replikationsgaffel progression ^2. Kendskabet til begivenhederne efter mødet af replisome med et nukleoprotein blok har tidligere været begrænset af den manglende evne til at inducere en sådan blok i kromosomet i en levende celle ved et kendt sted. In vitro analyse har forbedret vores forståelse af den kinetiske adfærd af en aktiv replisome når den møder en nukleoprotein blokering ^3, samt de mekanistiske detaljer af selve ^4,5 replisome. Nuværende forståelse af reparation af replikation er generelt foretages med UV som skadelige middel og undersøgt ved hjælp af plasmid-DNA in vivo ^6-8 </sop>. Mens de proteiner, der kan være involveret i reparation af DNA efter den møder en in vivo nukleoprotein blok forstås generelt fra disse undersøgelser, om der er variationer i de molekylære begivenheder inden for reparation veje på grund af tydelig årsag i replikation blok stadig endnu mangler at blive afklaret.

Her beskriver vi et system, der tillader en nukleoprotein blok at være etableret i et bestemt sted på kromosomet ved hjælp af en fluorescerende Repressor Operator System (Frøs). Vi benytter en stamme af E. coli, som har haft et array af 240 tetO sites inkorporeret i kromosomet ^9. Hver tetO sted inden i arrayet har en 10 bp tilfældig sekvens flankerende det at forøge stabiliteten af arrayet ved at forhindre RecA-medieret rekombination indenfor array'et. Dette array, og variationer af det, der oprindeligt blev brugt til at forstå E. coli kromosom dynamik ^10,11 men blev derefter tilpasset Prevent in vivo-replikation ^12. Grupperingen har vist sig at opretholdes stabilt og blokere tæt på 100% af replikationsgafler når bundet af TetR ^10,12. Anvendelsen af den tilsvarende lacO arrayet in vitro har fundet så få som 22 steder var tilstrækkelig til at blokere 90% af replikation, selv om dette kortere matrix var mindre effektivt in vivo ^13. For at tilpasse array til at skabe et nukleoprotein blokering, skal repressorproteinet være højt overproduceres under optimerede betingelser, hvor det derefter binder til arrayet for at skabe en vejspærring. Dannelsen af ​​blokeringen, og dens efterfølgende frigivelse, kan overvåges ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, hvis der anvendes en fluorescens mærkede variant af Tet-repressoren. Status for replikation i hver celle er angivet ved antallet af foci set hvor en enkelt brændpunkt betyder kun én kopi af arrayet er til stede i cellen og multiple foci er tegn på aktiv replikation. Denne aktive redelsen aktiveres, når nukleoprotein blokering reverseres ved tilsætning af den umotiveret inducer der reducerer bindingsaffiniteten af ​​TetR for operatøren stedet tilstrækkelig til replisome at fortsætte gennem arrayet. Repressorproteinet er stadig i stand til at binde til DNA med høj nok affinitet, at de nu flere kopier af arrayet kan visualiseres.

Mere indviklede detaljer i begivenhederne på nukleoprotein blokering kan opdages ved hjælp af neutral-neutral todimensional agarosegelelektroforese og Southern hybridisering ^14-16. Disse teknikker gør det muligt at analysere DNA-strukturer i befolkningen. Replikation mellemprodukter, der dannes under arrangementet, og potentielt forblive udbedrede, kan visualiseres. Ved at variere restriktionsenzym og probe anvendes, kan mellemprodukterne visualiseres ikke kun i array region, men også opstrøms for grupperingen, når replikationsgaflen regredere ^17,18. Detregression finder sted efter den replisome dissociation; de førende og tilbagestående nascente strenge adskilt fra templatestrengene og annealer til hinanden som templatestrengene samtidigt re-annealer resulterer i en fire-vejs DNA-struktur (a Holliday junction).

Anvendelse af dette system er det blevet vist, at replikationsgaflen er ikke stabilt, når det støder på denne blok ^18. Desuden kan temperaturfølsomme derivater af replisome komponenter anvendes til at forhindre ladning af replikationsgaflen når den er brudt sammen. Når en blok er etableret, kan stammen forskydes til en ikke-permissiv temperatur for at sikre en synkron deaktivering af replisome og en kontrolleret forebyggelse af ladning. Denne temperatur-induceret deaktivering sikrer alle gaflerne i befolkningen er kollapset på et givet tidspunkt og gør det muligt at vurdere, hvad der sker, når replisome kollapser, hvordan DNA'et er behandlet, og hvad der kræves for at restarte processen af ​​DNA-replikation.

En fordel ved den her beskrevne system er, at nukleoprotein blok er fuldt reversibel; derfor cellernes evne til at komme sig efter nukleoproteinet blok er i stand til at blive fulgt. Tilsætningen af ​​anhydrotetracycline til cellerne vil aflaste tæt binding af repressoren, hvilket tillader en replikationsgaflen at fortsætte gennem og cellen at genvinde levedygtighed. Lindring af blokeringen kan visualiseres ved neutral-neutral todimensional agarosegelelektroforese efter 5 minutter, og ved mikroskopi inden for 10 min. Endvidere kan levedygtighed analyse afsløre Stammens evne til at komme sig efter replikation blokering og fortsætte med at formere sig.

Ved at ændre den genetiske baggrund af stammerne anvendt i den eksperimentelle fremgangsmåde beskrevet her, kan reparation veje for denne type blokering blive belyst.

Protocol

1. Blokering replikering med Frøs Inducere Replication blokering Fortynd en frisk overnatskultur af en E. coli-stamme, der bærer en tetO array og pKM1 18 til OD 600 nm = 0,01 i en fortyndet komplekst medium (0,1% trypton, 0,05% gærekstrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika efter behov for udvælgelse. Bemærk: Du må ikke tilføje tetracyclin for valg, da det ikke er foreneligt m…

Representative Results

Den Frøs er en inducerbar stedspecifik nukleoprotein blok, der gør det muligt replikationsmellemprodukter der skal visualiseres i levende celler 12,18. En generel forsøgsplan til prøveudtagning celler er illustreret i figur 1. Timingen af prøveudtagning og variationer i genetisk baggrund gør dette til et alsidigt system til undersøgelse af reparation af en sådan blok. Den skematiske illustrerer, hvordan temperaturfølsomme mutanter, såsom DnaB</em…

Discussion

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…

Materials

Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 x 300mm