Indusere en Stedsspesifikk Replication Blokkering i<i> E. coli</i> Ved hjelp av en fluoriserende Repressor Operator System

Summary

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Hindringer stede på DNA, inkludert tett bundet proteiner og ulike lesjoner, kan alvorlig hemme utviklingen av cellens replikering maskiner. Den steiling av en replisome kan føre til dets dissosiasjon fra kromosomet, enten delvis eller fullstendig, som fører til kollaps av replikasjonsgaffelen. Gjenvinningen fra dette sammenbruddet er en nødvendighet for cellen å nøyaktig komp kromosomal duplisering og deretter dele. Derfor, når kollaps inntreffer, har cellen utviklet forskjellige mekanismer som finner sted for å gjenopprette den DNA-gaffel og tillate replikasjon for å være ferdig med høy nøyaktighet. Tidligere har disse replikasjon reparasjonsbaner i bakterier blitt undersøkt ved hjelp av UV-skader, noe som har ulempen av ikke å være lokalisert til et visst område. Dette manuskriptet beskriver et system som benytter en fluorescens Repressor Operator System (Frøs) for å skape et stedsspesifikt protein blokk som kan indusere steiling og kollaps av replikering foRKS i Escherichia coli. Protokoller detalj hvordan status for replikasjon kan visualiseres i enkle levende celler ved hjelp av fluorescens mikroskopi og DNA-replikasjonsmellomprodukter kan bli analysert ved to-dimensjonal agarosegelelektroforese. Temperatursensitive mutanter av replisome komponenter (f.eks DnaBts) kan være inkorporert i systemet for å indusere en synkron sammenbrudd av de replikasjonsgafler. Videre kan rollene til de rekombinasjon proteiner og heli som er involvert i disse prosessene studeres ved hjelp av genetiske knockouts i dette systemet.

Introduction

Under DNA replikasjon, den replisome møter hindringer på DNA som svekke dens progresjon. DNA-skader inkludert lesjoner og hull samt avvikende strukturer kan hindre replisome fra fortsetter ^en. Nylig har det blitt funnet at proteiner bundet til DNA er den vanligste kilde til hinder for replikering gaffel progresjon ^2. Kunnskapen om hendelsene etter møtet av replisome med en nukleoprotein blokk har tidligere vært begrenset av den manglende evne til å indusere en slik blokk i kromosomet til en levende celle på et kjent sted. In vitro-analyse har forbedret vår forståelse av den kinetiske oppførsel av en aktiv replisome når den møter en nukleoprotein blokkering ^3, så vel som de mekanistiske detaljer av replisome seg ^4,5. Nåværende forståelse for reparasjon av replikering er vanligvis gjennomført med UV som skadelig agent og studert ved hjelp av plasmid DNA in vivo ^6-8 </sopp>. Mens de proteinene som kan være involvert i reparasjon av DNA etter den støter på en in vivo-nukleoprotein blokken er generelt forstått fra disse studiene, uansett om det er variasjoner i de molekylære hendelser innen reparasjons trasé på grunn av den distinkte årsak i replikasjonen blokken er likevel ennå å være bestemt.

Her beskriver vi et system som gjør at en nucleoprotein blokk som skal etableres på et bestemt sted i kromosomet ved hjelp av en fluoriserende Repressor Operator System (Frøs). Vi bruker en stamme av E. coli som har hatt en rekke 240 Teto områder innlemmet i kromosom ^9. Hver Teto område i matrisen har en 10 bp tilfeldig sekvens som flankerer den til å øke stabiliteten av matrisen ved å hindre RecA-mediert rekombinasjon i matrisen. Denne rekken, og varianter av den, ble opprinnelig brukt til å forstå E. coli-kromosomet dynamikk ^10,11, men ble deretter tilpasset prevent in vivo replikering ^12. Matrisen har blitt funnet å være stabilt opprettholdt, og for å blokkere nær 100% av replikasjonsgafler når bundet av Tetr ^10,12. Bruken av lignende Laco matrisen in vitro har funnet så få som 22 områdene var tilstrekkelig til å blokkere 90% av replikasjon, selv om dette kortere matrisen var mindre effektiv in vivo ^13. For å tilpasse matrisen for å skape en nukleoprotein blokkering, må repressor-proteinet være sterkt overprodusert i henhold optimaliserte betingelser hvor det deretter binder seg til matrisen for å skape en hindring. Dannelsen av blokkeringen, og dens etterfølgende frigjøring, kan overvåkes ved bruk av fluorescens mikroskopi hvis en fluorescerende merket variant av Tet repressor blir brukt. Statusen til replikasjon i hver celle er indikert med antall foci sett, hvor et enkelt fokuspunkt betyr at bare ett eksemplar av matrisen er til stede i cellen og multiple brennpunkter er tegn på aktiv replikasjon. Denne aktive regrammet blir aktivert når nucleoproteins blokkeringen blir reversert ved tilsetning av umotivert inducer som reduserer bindingsaffiniteten tetra for operatøren området i tilstrekkelig grad for den replisome å fortsette gjennom matrisen. Den repressor-proteinet er fortsatt i stand til å binde til DNA med høy nok affinitet for at nå flere kopier av matrisen kan visualiseres.

Mer intrikate detaljer om hendelsene på nucleoprotein blokkering kan oppdages ved hjelp av nøytral-nøytral todimensjonal agarosegelelektroforese og Southern hybridisering ^14-16. Disse teknikker tillater analyse av DNA-strukturer i befolkningen. Replikering mellomprodukter som dannes under arrangementet, og potensielt forbli ureparert, kan visualiseres. Ved å variere restriksjonsenzym og probe anvendes, kan mellomproduktene bli visualisert ikke bare i matrisen regionen, men også på oppstrømsiden av matrisen når replikasjonsgaffelen regresses ^17,18. Deregresjon finner sted i etterkant av replisome dissosiasjon; de ledende og lagging begynnende tråder atskilt fra malen tråder og gløding til hverandre som malen tråder samtidig re-anneal resulterer i en fireveis DNA struktur (en Holliday krysset).

Ved hjelp av dette system har det vist seg at replikasjonsgaffelen er ikke stabil når den støter på denne blokken ^18. I tillegg kan temperaturfølsomme derivater av replisome komponenter benyttes for å forhindre omlasting av replikasjonsgaffelen når den har kollapset. Når en blokk blir etablert, kan belastningen flyttes til en ikke-permissive temperatur for å sikre en synkron deaktivering av replisome og en kontrollert forebygging av omlasting. Denne temperaturinduserte deaktivering sikrer at alle av gaflene i befolkningen har kollapset på et gitt tidspunkt, og tillater evaluering av hva som skjer når den replisome kollapser, hvor DNA blir behandlet, og det som er nødvendig for å gjenstarte prosessen med DNA-replikasjon.

En fordel med systemet beskrevet her er at nucleoproteins blokken er fullstendig reversibel; Derfor, evne til cellene for å komme seg fra nucleoproteins blokken er i stand til å bli fulgt. Tilsetningen av anhydrotetracycline til cellene vil avlaste den tette binding av repressor, slik at en replikasjons gaffel for å gå gjennom, og cellen for å gjenvinne levedyktighet. Lindring av blokkeringen kan visualiseres ved nøytral-nøytral todimensjonal agarosegel-elektroforese etter 5 min, og ved mikroskopi innen 10 min. Videre kan levedyktighet analyse åpenbare evne av stammen for å gjenopprette fra replikasjon blokkert og fortsette å spre seg.

Ved å endre den genetiske bakgrunn av stammene som anvendes i den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her, kan reparasjonsbaner for denne type blokkering bli belyst.

Protocol

1. Blokkering Replication med Frøs Indusere Replication blokkering Fortynn en frisk over natten kultur av en E. coli-stamme som bærer en Teto matrise og pKM1 18 til OD 600 nm = 0,01 i en fortynnet komplekst medium (0,1% trypton, 0,05% gjærekstrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika som kreves for valg. Merk: Ikke legg tetracyklin for utvalget som det ikke er kompatibelt med dette s…

Representative Results

Den Frøs er en induserbar, stedsspesifikke nucleoprotein blokk som gjør at replikering mellom å bli visualisert i levende celler 12,18. En generell eksperimentell design for prøvetaking celler er illustrert i figur 1. Tidspunktet for prøvetaking og variasjoner i genetisk bakgrunn gjør dette til et allsidig system for å studere reparasjon av en slik blokk. Den skjematiske illustrerer hvordan temperatursensitive mutanter som DnaB-ts og dnaC</…

Discussion

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…

Materials

Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 x 300mm