Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules<em> Escherichia coli</em>: Conception, production et purification

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

Un intérêt croissant pour l'application des techniques de biologie synthétique pour programmer des vésicules de la membrane externe (OMV) conduisent à des applications très intéressantes et uniques pour OMV où nanoparticules traditionnelles se révèlent trop difficiles à synthétiser. A ce jour, toutes les bactéries à Gram négatif ont été montrés pour produire OMV démontrant l'emballage d'une variété de marchandises qui comprend des petites molécules, des peptides, des protéines et du matériel génétique. Sur la base de leur cargaison diverse, OMV sont impliqués dans de nombreux processus biologiques allant de la communication cellulaire pour le transfert de gènes et la fourniture de facteurs de virulence en fonction de laquelle les bactéries produisent le OMV. ont seulement récemment OMV bactérienne devenue accessible pour une utilisation dans un large éventail d'applications à travers le développement des techniques de contrôle et de conditionnement direct de protéines recombinantes dans OMV. Ce protocole décrit un procédé pour la production, la purification et l'utilisation de l'enzyme conditionnée OMV permettant une meilleure overaproduction ll d'enzyme recombinante, une augmentation de vésiculation, et amélioré la stabilité de l'enzyme. l'utilisation réussie de ce protocole va entraîner la création d'une souche bactérienne qui produit simultanément une protéine recombinante et la dirige pour l'encapsulation d'OMV en créant une liaison entre la protéine synthétique et d'une protéine recombinante d'ancrage de la membrane externe. Ce protocole détaille également les méthodes pour isoler OMV à partir de cultures bactériennes ainsi que des techniques de manipulation appropriées et des choses à considérer lors de l'adaptation de ce protocole d'utilisation pour d'autres applications uniques telles que: la livraison de médicaments pharmaceutiques, les diagnostics médicaux, et à l'assainissement de l'environnement.

Introduction

Nous présentons ici une méthode pour la conception, la production et la purification des bactéries vésicules de membrane externe de l'enzyme chargée (OMV). OMV sont petites, principalement unilamellaires, protéoliposomes qui varient en taille de 30 à 200 nm de ^1,2. Toutes les bactéries Gram-négatives et Gram-positives qui ont été étudiés à ce jour ont démontré la libération des deux OMV ou vésicules extracellulaires (EV) à partir de leur surface ^3,4. Le mécanisme précis par lequel OMV sont produites doivent encore être complètement élucidé en raison des populations bactériennes diverses qui les ainsi que les fonctions variables qu'ils servent sécrètent. OMV a été démontré que pour transporter un large éventail de marchandises à partir de petites molécules, des peptides et des protéines au matériel génétique servant une variété de signalisation complexe, translocation du gène, et les fonctions de virulence ^5,6.

Les mécanismes exacts de OMV biogenèse ne sont pas bien caractérisées, et semblent différer entre les espèces bactériennes. Malgré thide fait, nous avons mis au point un procédé pour améliorer l'efficacité de l'emballage d'une protéine recombinante dans OMV en créant une liaison entre une protéine synthétique d'intérêt et d'une protéine endogène très abondant à la membrane externe bactérienne et OMV ultérieure. En l'absence d'une liaison synthétique, ou une affinité incorporée artificiellement entre la protéine exprimée de manière recombinante et OMV l'efficacité de l' emballage est très faible observée ^7. Ce résultat est à prévoir que l'incorporation des protéines au sein de l'OMV soit se produit par hasard encapsulation par hasard au moment précis de la formation OMV à la surface bactérienne ou par emballage dirigé par des mécanismes qui ne sont pas bien comprises. Un certain succès a été observé dans l'emballage de protéines simplement par-dessus l'expression dans l'espace périplasmique qui repose sur l'encapsulation de hasard, mais l'emballage efficace est hautement la protéine dépendante avec des protéines d'emballage à haute efficacité par rapport à d'autres eà ne pas emballer du tout ^8-10. En utilisant des techniques de biologie synthétique communs , nous avons cherché à concevoir Escherichia coli (E. coli) pour produire simultanément, ensemble et sécrètent une enzyme active d'intérêt dans OMV qui contourne les limites des connaissances actuelles sur la façon dont OMV sont formés et comment la cargaison est sélectionnée par les bactéries pour emballage.

Aux fins de cette application, un système de la protéine bioconjugaison scission a été choisi comme le lien synthétique de choix pour faciliter l'emballage directionnel dans le OMV. Comme le nom l'indique, un système de bioconjugaison protéine intermédiaire est constituée de deux domaines de sous-unités complémentaires qui interagissent les unes avec les autres. Les domaines protéiques split sélectionnés aux fins de ce protocole sont désignées sous le nom de SpyCatcher (SC) et SpyTag (ST) domaine et sont dérivées de la pyogenes fibronectine-binding protein Streptococcus (FBAB) ^11. Ce système de protéines de division est inhabituel en ce worsque les deux sous-unités sont dans la proximité d'une liaison isopeptidique forme spontanément entre les extrémités proximale aspartique résidus d'acides aminés acides et la lysine en créant une liaison covalente. Formation d' une liaison isopeptidique ne nécessite pas l'addition de protéines chaperons, des enzymes catalytiques, ou des cofacteurs et peut facilement se produire à la température ambiante (RT) et sur une large gamme de conditions physiologiquement pertinentes ^12.

Comme une preuve de concept, phosphotriestérase (PTE) (EC 3.1.8.1) de Brevundimonas diminuta a été sélectionné pour être emballé dans E. coli dérivé OMV ^13. PTE contient un site actif Zn / Zn binucléaire et a la capacité de décomposer les organophosphates par une réaction d'hydrolyse convertissant aryldialkylphosphates en dialkylphosphates et alcools aryliques ^14. L'exposition aux organophosphorés altère le bon fonctionnement des neurotransmetteurs en inhibant l'hydrolyse de l'acétylcholine par l'acétylcholinestérase au neuromusculaires jonctions makincomposés g organophosphorés dérivés extrêmement dangereuses ^15. L' exposition prolongée ou significative aux organophosphorés entraîne fréquemment des convulsions incontrôlables et provoque généralement la mort par asphyxie. Bien que PTE présente l'activité catalytique la plus élevée vers paraoxone, un insecticide très puissant, il est également capable d'hydrolyser un large éventail d'autres pesticides et V / G de type agents neurotoxiques chimiques ^16. Pour faciliter l'emballage d'OMV, un plasmide bactérien a été conçu qui code pour un produit de construction génique qui contient un promoteur inductible, une séquence de localisation périplasmique et un site de clonage multiple courte en amont de la séquence du gène SC. Insertion du gène de SDT entre le leader et la séquence SC a permis la création d'un commutateur génétique qui cible la protéine de fusion SDT-SC vers l'espace périplasmique pour le conditionnement d'OMV. Alors que les efforts décrits ici portent sur SDT, le gène de l'enzyme est interchangeable et peut être facilement remplacée par une autre séquence de gène de facemballage ilitate d'une autre enzyme ou d'une protéine.

La deuxième partie de la liaison synthétique, une protéine de la membrane externe abondant (OmpA) est choisi pour présenter la séquence peptidique ST. Bien que le choix de la protéine d'ancrage peut varier, il est essentiel que la protéine possède un domaine permissif qui se présente dans l'espace périplasmique, tolère la construction de fusion sans induire une cytotoxicité, est connu pour être présent dans OMV et ne regroupe pas quand il est recombinaison produite. OmpA est une protéine de 37,2 kDa transmembranaire porine qui est connu pour être fortement exprimé dans la membrane externe des bactéries et après ¹⁷ OMV. Elle est impliquée dans le transport de petites molécules, <2 nm de diamètre, à travers la membrane bactérienne ^18. Natif OmpA possède deux domaines structurellement uniques, un motif de fût transmembranaire bêta et une partie C-terminale periplasmically soluble connu pour interagir avec le peptidoglycane ^19. Dans le mutant OmpA-ST fusion designed ici la partie C-terminale de l'OmpA a été supprimé et le ST a été fusionné à l'extrémité N- face periplasmically ou C-terminales. Suppression de la partie périplasmique de OmpA diminue le nombre d'interactions entre la membrane externe et le peptidoglycane entraînant la déstabilisation de la membrane conduisant à l' hyper-vesiculation ^7. Gnomique OmpA a été maintenue en plus du exprimé de manière recombinante OmpA-ST construction brute pour atténuer la déstabilisation de la membrane.

Protocol

1. Préparation de Plasmides Préparer un plasmide (par exemple, pET22) contenant la protéine d'ancrage (OmpA) fusionné à un domaine de liaison biorthogonal (dénommé dans le présent protocole d' ancrage-ST), marqueur d'épitope (comme 6xHis, myc ou FLAG balises pour la purification et l' identification), tag périplasmique de localisation, la résistance aux antibiotiques, et l' origine de réplication appropriée en fonction de la souche bactérienne sélectionnée 7.<…

Representative Results

L'expression simultanée de deux protéines recombinantes, comme cela est nécessaire pour la stratégie d'emballage OMV détaillée dans ce protocole, peut être accompli par un certain nombre de différentes avenues. Ici, un système à deux vecteur a été utilisé avec des origines de replication compatibles et cassettes de gènes inductibles séparés. Pour l'expression de la SDT-SC construire un squelette de plasmide commercial (pACY184) a été modifié pour inclure un…

Discussion

Ces fonctions de protocole pour démontrer un représentant dirigé technique d'emballage dans lequel une enzyme d'intérêt est produite et conditionnée par OMV dans E. coli. Comme avec beaucoup de techniques complexes, il existe de multiples domaines dans lesquels le protocole peut être modifié pour tenir compte pour une utilisation dans différentes applications uniques, dont certaines sont détaillées ci-dessous. Bien que le mécanisme d'OMV emballage et de l'enzyme encapsulation peut ê…

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.