Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em> Кишечная палочка</em>: Проектирование, производство и очистка

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

Увеличивается интерес к применению методик синтеза биологии для программирования везикул наружной мембраны (OMV) приводят к очень интересным и уникальных приложений для OMV, где традиционные наночастицы оказываются слишком трудно синтезировать. На сегодняшний день все грамотрицательные бактерии, как было показано, чтобы произвести OMV, демонстрирующих упаковки разнообразных грузов, который включает небольшие молекулы, пептиды, белки и генетический материал. На основании их разнообразных грузов, OMV, участвуют во многих биологических процессах, начиная от межклеточной связи для переноса генов и доставки факторов вирулентности, в зависимости от которых бактерии производить OMV. Только в последнее время бактериальные OMV становятся доступными для использования в широком диапазоне применений путем разработки методов контроля и прямой упаковки рекомбинантных белков в OMV. Этот протокол описывает способ производства, очистки и использования фермента упаковывают OMV, предусматривающий улучшена Overaпроизводство Л.Л. рекомбинантного фермента, повышенной везикуляцией и повышенной стабильности фермента. Успешное использование этого протокола приведет к созданию бактериального штамма, который одновременно производит рекомбинантный белок и направляет его для OMV капсулирования путем создания синтетической связи между рекомбинантным белком и белком наружной мембраны в анкерной. Этот протокол также подробно методы выделения OMV из бактериальных культур, а также надлежащих методов обработки и вещей, которые следует учитывать при адаптации этого протокола для использования для других уникальных приложений, таких как: фармацевтическая доставки лекарственных средств, медицинской диагностике и восстановлению окружающей среды.

Introduction

Представленный здесь метод для проектирования, производства и очистки ферментных загруженным бактериальных везикул наружной мембраны (OMV). OMV невелики, в первую очередь однослойными, протеолипосомы , которые варьируются в размерах от 30-200 нм ^1,2. Все грамотрицательных и грамположительных бактерий , которые были изучены на сегодняшний день продемонстрировали выпуск либо OMV или внеклеточного везикул (EV) с их поверхности ^3,4. Точный механизм, с помощью которого производится OMV, еще не выяснена из-за разнообразных популяций бактерий, которые секретируют их, а также различные функции, которые они обслуживают. OMV было показано для транспортировки широкого спектра грузов из малых молекул, пептидов и белков генетического материала , где подают разнообразные сложные сигнализации, транслокации генов и вирулентности функции ^5,6.

Точные механизмы OMV биогенезе не хорошо охарактеризованы, и, по всей видимости различаются между видами бактерий. Несмотря на Тхиs факт, мы разработали метод для повышения эффективности упаковки рекомбинантного белка в OMV, создавая искусственную связь между интересующим белком и весьма распространенный белок эндогенными по отношению к бактериальной внешней мембране и последующей OMV. При отсутствии синтетического связывания, или искусственно включенной сродства между рекомбинантно экспрессировать белок и OMV наблюдаемая эффективность упаковки очень низкая ^7. Этот результат следует ожидать, как включение белков внутри OMV либо происходит через случайный шанс инкапсуляцией именно в тот момент формирования OMV на бактериальной поверхности, или с помощью направленной упаковки с помощью механизмов, недостаточно хорошо изучены. Некоторые успехи были отмечены в упаковки белки просто через более чем выражение в периплазматическое пространство, которое опирается на случайный шанс инкапсуляция, но эффективной упаковки очень белков зависит с некоторыми белками упаковка на высокую эффективность по сравнению с другими мна не пакет вообще ^8-10. Используя общие методы синтетической биологии мы стремились инженер кишечной палочки (E.coli) , чтобы одновременно производить, упаковки и секретировать активный интерес фермент в OMV , который обходит существующие ограничения знаний относительно того, как формируются OMV и как груз выбирается для бактерий упаковка.

Для целей настоящего приложения сплит-системы белка биоконъюгации была выбрана в качестве синтетического увязка выбора для облегчения направленного упаковки в OMV. Как следует из названия сплит-системы белка биоконъюгации состоит из двух дополняющих друг друга областей субъединиц, которые взаимодействуют друг с другом. Раскол белковые домены , выбранные для целей настоящего протокола упоминаются как SpyCatcher (SC) и SpyTag (ST) области и являются производными от Streptococcus Пирролидонилпептидаза фибронектин-связывающего белка (FbaB) ^11. Эта система сплит белок является необычным в том, что WКурица двух субъединиц находятся в пределах досягаемости isopeptide связь спонтанно образует между проксимальным аспарагиновой кислоты и лизина аминокислотных остатков, создающих ковалентной связи. Формирование Isopeptide связь не требует добавления белков – шаперонов, каталитические ферменты или кофакторов , и может легко происходить при комнатной температуре (RT) и в широком диапазоне физиологически соответствующих условий ^12.

Как доказательство концепции, была выбрана phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) от Brevundimonas diminuta быть упакованы в E.coli , полученный OMV ^13. PTE содержит двухъядерный активный сайт Zn / Zn и обладает способностью расщеплять органофосфаты посредством реакции гидролиза конвертерной aryldialkylphosphates в dialkylphosphates и арильных спиртов ^14. Воздействие органофосфатам ослабляет надлежащую функцию медиатора через ингибирования гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечных синапсах Макинг фосфорорганические соединения , полученные чрезвычайно опасные ^15. Длительное или значительное воздействие органофосфатам обычно приводит к неконтролируемым судорогам и обычно приводит к смерти через асфиксию. В то время как ПТЭ демонстрирует самую высокую каталитическую активность по отношению к параоксон, очень мощный инсектицид, он также способен гидролизовать широкий спектр других пестицидов и V / тип G химические нервно – паралитических веществ ^16. Для облегчения OMV упаковки, бактериальной плазмиды была разработана, который кодирует ген конструкцию, содержащую индуцируемый промотор, периплазматического последовательность локализации и короткий сайт множественного клонирования выше последовательности гена СК. Введение гена PTE между лидерной последовательностью и последовательностью SC позволило для создания генетического переключателя, мишенью которого слитый белок ПТЭ-SC в периплазматическое пространство для OMV упаковки. Хотя усилия, описанные здесь, сосредоточены на ПТЭ, ген фермента является взаимозаменяемым и может быть легко заменена другой последовательностью гена к FACilitate упаковка альтернативного фермента или белка.

В качестве второй части синтетической связи, обильное белок наружной мембраны (OmpA) выбирают так, чтобы представить пептидную последовательность ST. В то время как выбор анкерной белка может варьироваться, важно, что белок имеет разрешающий домен, который представляет в периплазматическом пространстве, переносит слитой конструкции без индукции цитотоксичности, как известно, присутствует в OMV, и не агрегирует, когда она является рекомбинантным производится. OmpA является 37,2 кДа трансмембранный порин белок , который , как известно, высоко выражена в бактериальной внешней мембране и последующего OMV ^17. Он участвует в транспорте малых молекул, <2 нм в размере, по всей бактериальной мембраны ^18. Родной OmpA имеет два структурно уникальные домены, трансмембранный бета ствол мотив и periplasmically растворимый С-концевой части , как известно, взаимодействуют с пептидогликана ^19. В мутантного OmpA-ST слитого Designed здесь С-концевую часть OmpA был удален, а ST был слит с periplasmically обращенной N- или С-концами. Удаление периплазматическому часть OmpA уменьшает количество взаимодействий между наружной мембраной и пептидогликана , что приводит к дестабилизации мембраны , приводящей к гипер- везикуляцией ^7. Геномные OmpA поддерживалось в дополнение к рекомбинантно экспрессировать OmpA-ST конструкции для смягчения грубой мембранной дестабилизацию.

Protocol

1. Получение плазмид Приготовьте плазмиды (например, pET22) , содержащий белок якорный (ОмПО) , слитый с биортогональнои области связей (называемый в этом протоколе в качестве якорного-ST), эпитоп тег (например, 6xHis, Myc или FLAG тегов для очистки и идентификации), периплазматический лок…

Representative Results

Одновременная экспрессия двух рекомбинантных белков, как это требуется для упаковочной стратегии OMV, рассмотренное в данном протоколе, может быть достигнуто с помощью ряда различных путей. Здесь два вектора система была использована с совместимыми начала репликации…

Discussion

Этот протокол функционирует с целью подтверждения представителя направленной упаковочной техники , в которой фермент интерес производится и упаковывается в OMV кишечной палочки. Как и в случае многих сложных методов существует множество областей, в которых протокол может быть из?…

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.