Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em> Escherichia coli</em>: Tasarım, Üretim ve Arıtma

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

dış membran veziküller (OMV) programlamak için sentetik biyoloji teknikleri uygulayarak giderek artan ilgi, geleneksel nanopartiküller sentezlemek için çok zor kanıtlamaktadır OMV'ye için bazı çok ilginç ve benzersiz uygulamalara yol açmaktadır. Bugüne kadar, bütün Gram negatif bakterilerin küçük moleküller, peptitler, proteinler ve genetik malzemesi içeren kargo çeşitli OMV Gösteren ambalaj üretmek için gösterilmiştir. onların çeşitli yük göre OMV hücre-hücre iletişim gen transferi ve bakteri OMV üretiminde hangi bağlı olarak hastalık oluşturma faktörlerinin teslimat kadar birçok biyolojik süreçlere de karışırlar. Sadece son zamanlarda bakteriyel OMV kontrol etmek ve OMV içine rekombinant proteinlerin doğrudan ambalaj tekniklerinin geliştirilmesi yoluyla geniş bir uygulama yelpazesinde kullanım için erişilebilir hale gelmiştir. overa geliştirilmiş Bu protokol, üretimi, saflaştırılması için bir yöntem, ve enzim paketlenmiş OMV kullanımını temin tarifrekombinant enzim, artan vezikülasyon ve gelişmiş enzim stabilitesi ll üretimi. Bu protokolün başarılı kullanımı aynı zamanda, bir rekombinant protein üretimi ve yeniden birleştirici protein ve bir dış membran ankraj protein arasında sentetik bağlantı oluşturma yoluyla OMV kapsüllenmesi için yönlendiren bir bakteri suşunun oluşturulmasıyla sonuçlanır. ilaç ilaç dağıtım, tıbbi teşhis ve çevresel iyileştirme: Bu protokol ayrıca gibi diğer benzersiz uygulamalar için kullanılmak üzere bu protokolü adapte göz önünde bulundurulması gereken bakteri kültürlerinin yanı sıra uygun işleme teknikleri ve şeyler OMV izole etmek için yöntemler göstermektedir.

Introduction

Enzim yüklü bakteriyel dış membran veziküllerinin (OMV) tasarımı, üretim ve saflaştırma için bir yöntem olup burada sunulmuştur. OMV, 30-200 nm ^1,2 büyüklükleri değişen proteoliposomes öncelikle tek katmanlı, küçük. Bugüne kadar incelenen tüm gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriler, yüzey ^3,4 OMV veya hücre dışı vesiküller (EV), ya serbest göstermiştir. OMV üretildiği kesin mekanizma henüz tam olarak nedeni onları yanı sıra hizmet ettikleri farklı işlevleri salgılayan çeşitli bakteri nüfusa açıklanacaktır zorunda. OMV kompleksi arası iletimde, gen translokasyon çeşitli hizmet genetik malzemenin küçük moleküller, peptitler ve proteinler yükün geniş taşıma gösterilmiştir ve hastalık oluşturma ^5,6 çalışır.

OMV biogenez kesin mekanizmaları iyi karakterize ve bakteriyel türler arasında farklılık göstermedi değildir. thi rağmens aslında, ilgi bir protein ve bakteriyel dış zar için son derece fazla protein endojen ve daha sonra OMV ile sentetik bir bağ oluşturarak OMV bir rekombinant proteinin ambalaj etkinliğinin arttırılması için bir yöntem geliştirdik. Sentetik bağlantı ya da yapay olarak dahil afinitesi yokluğunda, rekombinant şekilde sentezlenmiş protein ile OMV arasında gözlenen paketleme verimliliği ⁷ çok düşüktür. Bu sonuç, iyi anlaşılmış değildir mekanizmalar yoluyla bakteriyel yüzeye ya da yönlendirilmiş paketleme ile OMV formasyonunun kesin bir anda rastgele olasılık kapsülleme yoluyla gerçekleşir OMV içindeki proteinler dahil edilmesi gibi beklenebilir. inci kıyasla yüksek verimde ambalaj bazı proteinleri ile bağlı protein yüksek bir başarı rastgele olasılık kapsülleme ama etkili paket dayanır periplazmik boşluk içinde ekspresyonu üzerinde, sadece yoluyla proteinlerin paketleme gözlenmiştir olduğutüm ^8-10'da paket yok. Ortak sentetik biyoloji tekniklerini kullanarak biz Escherichia coli (E.coli) aynı anda üretmek, paket ve kargo için bakteriler tarafından seçilir nasıl OMV oluşturulur ve nasıl ilgili güncel bilgi sınırlamaları ortadan OMV içine ilgi aktif bir enzim salgılaması için mühendis çalıştı ambalaj.

tercih edilen, sentetik bağlantı OMV içine yönsel ve paketlemeyi kolaylaştırmak için, bu başvurunun amaçları için, bir bölme proteini bioconjugation sistemi seçildi. Adından da anlaşılacağı gibi bölünmüş bir protein bioconjugation sistemi birbirleriyle etkileşim iki tamamlayıcı alt birim etki oluşur. Bu protokolün amacıyla seçilen bölünmüş protein domainleri Streptococcus pyogenes fibronektin bağlama proteini (FbaB) ¹¹ elde edilir SpyCatcher (SC) SpyTag (ST) etki gibi ifade edilir. Bu bölme, protein sisteminin bu w sıradışıTavuk, iki alt birimi yakınlık içinde isopeptide bağ spontan bir kovalent bağ oluşturma asit ve lizin amino asit kalıntıları, aspartik proksimal arasında oluşturur. Isopeptide bağı oluşumu şaperon protein, katalitik enzimlerin veya kofaktörlerin eklenmesini gerektirmez ve kolayca, oda sıcaklığında (RT) ve fizyolojik olarak ilgili ^{koşullar, 12,} geniş bir aralıkta meydana gelebilir.

Kavramının bir kanıtı olarak, Brevundimonas diminuta gelen phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) OMV ¹³ türetilmiş E. coli 'içine paketlenmiş seçildi. PTE binükleer Zn / Zn etkin bir yeri içerir ve Dialkilfosfatlar ve aril alkolleri ^14'e aryldialkylphosphates dönüştürme bir hidroliz reaksiyonu ile organofosfatlar ayrıştırma kabiliyeti yer alır. Organofosfatlar maruz kalma nöromüsküler kavşak makin de asetilkolinesteraz tarafından asetilkolin hidrolizini inhibe yoluyla uygun nörotransmitter fonksiyonu bozar¹⁵ derece tehlikeli g organofosfat türetilmiş bileşikler. Uzun süreli veya Organofosfatlar önemli maruziyet sık kontrol edilemeyen kasılmalar oluşur ve genellikle boğulma yoluyla ölüme neden olur. PTE paraokson doğru yüksek bir katalitik aktivite sergiler ise, çok güçlü bir insektisit, aynı zamanda diğer ilaç ve V / G tip kimyasal sinir ajanları ¹⁶ geniş bir hidrolize yeteneğine sahiptir. OMV ve paketlemeyi kolaylaştırmak için bir bakteriyel plazmid indüklenebilir bir promotör, bir periplazmik lokalizasyon sekansını ve SK gen dizisinin üst akışında bir kısa çoklu klonlama yerini içeren bir gen yapısı kodlayan tasarlanmıştır. OMV ambalaj periplazmik bölgeye PTE-SC füzyon proteinini hedefleyen genetik anahtarın oluşturulması için izin lideri ve SC sekansı arasındaki PTE geninin yerleştirilmesi. Burada tarif edilen çalışmalar PTE odaklanırken, enzim gen değiştirilebilir ve hali hazırda Fakültesi için diğer bir gen sekansı ile değiştirilebilirAlternatif bir enzim veya protein ilitate ambalaj.

Sentetik bağlantı ikinci bir parçası olarak bir çok dış zar proteini (OmpA) Abone terminali peptid dizisi sunmak tercih edilir. değişebilir bağlantı proteininin tercih protein, periplazmik boşluk içinde sunulur permisif alan adına sahip sitotoksisite neden olmadan bir füzyon yapısı tolere esastır iken rekombinant olduğunda, OMV mevcut olduğu bilinmektedir, ve toplam etmez üretilmiş. OmpA yüksek bakteriyel dış zar ve daha sonra OMV ^17'de ifade edildiği bilinen bir 37.2 kDa transmembran Porin proteinidir. Küçük moleküllerin taşınması karıştığı, bakteri membranı ¹⁸ arasında, boyutu 2 nm <. Ana OmpA iki yapısal benzersiz etki, bir transmembran p varil motif ve peptidoglikan ¹⁹ ile etkileşim için bilinen periplasmically çözünebilir bir C-terminal bölümüne sahiptir. Mutant OmpA-ST füzyon designe olarakBuradaki D ompA C-terminal kısmı silinmiştir ve ST periplasmically bakan N- ya da C-ucu ile kaynaştırılır. OMPA periplazmik bölümünü silme dış membran ve hiper-vezikülasyon ⁷ giden membran istikrarsızlaştırma sonuçlanan peptidoglikan arasındaki etkileşimlerin sayısını azaltır. Genomik OmpA Brüt membran destabilizasyonuna azaltmak için, rekombinant şekilde eksprese OmpA-ST yapısına ek olarak muhafaza edildi.

Protocol

Plazmidler hazırlanması 1. Bir (çapa-ST olarak bu protokolde anılacaktır) çiftdikgen bağlantı etki kaynaşmış plazmid (örneğin, pET22) çapa protein içeren (OmpA), epitop etiketi (örneğin saflaştırma ve tanımlama için 6xHis, myc veya BAYRAK etiketleri gibi) hazırlayın periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve seçilen bakteri suşunun 7 göre çoğaltma uygun kökeni. Üreticinin protokolü takip edilerek, bir ticari olarak temin edilebilir DNA …

Representative Results

Bu protokol ayrıntılı OMV ambalaj stratejisi için gerekli olduğu gibi, iki yeniden birleştirici proteinin aynı anda sentezlenmesi, farklı yollar bir numara ile gerçekleştirilebilir. Burada, bir iki vektör sistemi çoğaltma ve ayrı olarak uyarılabilir gen kasetlerinin uyumlu kökeni ile kullanılmıştır. PTE-SC sentezlenmesi için bir arabinoz, indüklenebilir gen kaseti ve bir enzim geninin klonlanmasını kolaylaştırmak için benzersiz sınırlama sitelerinin bir dizi …

Discussion

Temsilcisi göstermek için bu protokol işlevleri, ilgili bir enzim üretimi ve E. coli OMV içine paketlenmiş olan bir paketleme tekniği yöneliktir. birçok karmaşık tekniklerle de protokol aşağıda ayrıntılı olarak bazıları, farklı özel uygulamalarda, kullanım için uyum için değiştirilebilir olan birden çok alan vardır. OMV paketleme ve enzim kapsülleme mekanizması özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir olsa da başarısı için kritik olan bu protokol kapsamında birkaç adım …

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.