Regissert Protein Emballasje innen ytre membran Blemmer fra<em> Escherichia coli</em>: Design, produksjon og rensing

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

En økende interesse for å bruke syntetiske biologiske teknikker for å programmere ytre membran vesikler (OMV) fører til noen svært interessante og unike applikasjoner for OMV hvor tradisjonelle nanopartikler er vist seg for vanskelig å syntetisere. Hittil har alle gram-negative bakterier som er vist å fremstille OMV demonstrere emballering av en rekke last som inkluderer små molekyler, peptider, proteiner og genetisk materiale. Basert på deres mangfoldige last, er OMV innblandet i mange biologiske prosesser som strekker seg fra celle-celle kommunikasjon til genoverføring og levering av virulensfaktorer avhengig av hvilke bakterier produserer den OMV. Bare nylig har bakteriell OMV blitt tilgjengelig for bruk over et bredt spekter av applikasjoner gjennom utvikling av teknikker for å kontrollere og direkte pakking av rekombinante proteiner i OMV. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling, rensing og bruk av enzym pakket OMV sørge for forbedret Overall produksjon av rekombinant enzym, økt blæredannelse, og forbedret enzymstabilitet. Vellykket anvendelse av denne protokollen vil resultere i dannelsen av en bakteriestamme som samtidig produserer en rekombinant protein og dirigerer det til OMV innkapsling gjennom å skape en syntetisk kobling mellom det rekombinante protein og et ytre membranprotein anker. Denne protokollen detaljer også metoder for å isolere OMV fra bakteriekulturer samt riktig håndtering teknikker og ting å vurdere når tilpasse denne protokollen for bruk for andre unike applikasjoner som: farmasøytiske stoffet levering, medisinsk diagnostikk, og miljøtiltak.

Introduction

Presenteres her er en metode for design, produksjon og rensing av enzym lastet bakterie ytre membran vesikler (OMV). OMV er små, primært unilamelære, proteoliposomes som varierer i størrelse 30-200 nm ^1,2. Alle Gram-negative og Gram-positive bakterier som er studert hittil har vist frigivelse av enten OMV eller ekstracellulære vesikler (EV) fra deres overflate ^3,4. Den nøyaktige mekanismen som OMV er produsert har ennå ikke helt klarlagt på grunn av de ulike bakteriepopulasjoner som skiller dem, samt varierende funksjoner som de tjener. OMV har vist seg å transportere et bredt spekter av last fra små molekyler, peptider og proteiner til genetisk materiale tjener en rekke komplekse signalisering, transgenet, og virulens fungerer ^5,6.

De nøyaktige mekanismer OMV biogenese er ikke godt karakterisert, og ser ut til å variere mellom bakteriearter. Til tross this Faktisk har vi utviklet en fremgangsmåte for å forbedre innpakning effektiviteten av et rekombinant protein i OMV ved å skape en syntetisk kobling mellom et protein av interesse og et svært rikt protein endogent for den bakterielle ytre membran og påfølgende OMV. I fravær av en syntetisk binding, eller kunstig innlemmet affinitet, mellom det rekombinant uttrykte proteinet og OMV den observerte emballasjen effektivitet er meget lavt ^7. Dette resultatet er å forvente som innlemmelse av proteiner i OMV enten skjer gjennom tilfeldige innkapsling i det øyeblikket av OMV dannelse ved bakterieoverflaten eller gjennom rettet innpakning av mekanismer som ikke er godt forstått. En viss suksess er blitt observert i emballasje proteiner ganske enkelt gjennom over uttrykk i det periplasmatiske rom som er avhengig av tilfeldigheter innkapsling men effektiv pakking er sterkt proteinavhengig med noen proteiner emballasje med høy virkningsgrad i forhold til andre thved ikke å pakke det hele tatt ^8-10. Ved å benytte vanlige syntetiske biologiske teknikker vi søkt å konstruere Escherichia coli (E. coli) å samtidig produsere, pakke og utsondrer en aktiv enzym av interesse i OMV som omgår dagens kunnskaps begrensninger når det gjelder hvordan OMV dannes og hvordan lasten er valgt av bakterier for emballasje.

Ved anvendelsen av dette programmet en split protein bioconjugation systemet ble valgt som syntetiske kobling av valget for å lette retnings emballasje inn i OMV. Som navnet antyder en split protein bioconjugation system består av to komplementære underenhets domener som interagerer med hverandre. Splitt proteindomener som velges for anvendelsen av denne protokollen blir referert til som spycatcher (SC) og SpyTag (ST) domene og er avledet fra Streptococcus pyogenes fibronektin-bindende protein (FbaB) ^11. Dette delte proteinsystem er uvanlig ved at whøne de to subenheter er innenfor nærhet en isopeptide bindingen spontant danner mellom den nære asparaginsyre og lysin aminosyreresidier skaper en kovalent binding. Isopeptide bindingsdannelse ikke krever tilsetning av chaperonproteiner, katalytiske enzymer eller kofaktorer og kan lett forekomme ved romtemperatur (RT) og over et bredt område av fysiologisk relevante betingelser ^12.

Som et bevis på konseptet, ble phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) fra Brevundimonas diminuta valgt å bli pakket inn i E. coli stammer OMV ^13. PTE inneholder et binuclear Zn / Zn-aktive sete og har evnen til å bryte ned organofosfater gjennom en hydrolysereaksjon omdannelse aryldialkylphosphates til dialkylphosphates og aryl-alkoholer ^14. Eksponering for organofosfater svekker riktig signalfunksjon gjennom å hemme hydrolyse av acetylkolin ved acetylkolinesterase ved nevromuskulære veikryss Making organofosfat avledet forbindelser ekstremt farlige ^15. Langvarig eller betydelig eksponering for organofosfater som vanligvis resulterer i ukontrollerte kramper og vanligvis fører til døden via kvelning. Mens PTE oppviser den høyeste katalytiske aktivitet mot paraokson, en meget potent insekticid, er det også i stand til å hydrolysere et bredt spekter av andre plantevernmidler og V / G typen kjemisk nervemidler ^16. For å lette OMV emballasje, ble et bakterielt plasmid konstruert som koder for en genkonstruksjon som inneholder en induserbar promoter, et periplasmatisk lokalisering sekvens, og en kort multippelt kloningssete oppstrøms for SC-gensekvensen. Innsetting av PTE genet mellom leder og SC sekvens tillatt for etablering av en genetisk bryter som er rettet mot PTE-SC fusjonsprotein til periplasmarommet for OMV emballasje. Mens arbeidet som er beskrevet her fokusere på PTE, er enzymet genet utskiftbare og kan lett erstattes med en annen gensekvensen til Facilitate emballering av en alternativ enzym eller protein.

I den andre delen av det syntetiske binding, er en rikelig ytre membranprotein (OmpA) valgt å presentere den ST peptid-sekvens. Mens valget av ankeret protein kan variere, er det viktig at proteinet har en ettergivende domene som presenterer i det periplasmatiske rom, tåler fusjonskonstruksjon uten å indusere cytotoksisitet, er kjent for å være tilstede i OMV, og som ikke aggregerer når det er rekombinant produsert. OmpA er en 37,2 kDa trans porin proteiner som er kjent for å være sterkt uttrykt i den bakterielle ytre membran og påfølgende OMV ^17. Den er involvert i transport av små molekyler, <2 nm i størrelse, på tvers av bakterielle membranen ^18. Native OmpA har to strukturelt unike domener, et transmembran beta fat motiv og et periplasmically løselige C-terminale del kjent for å interagere med det peptidoglykan ^19. I mutant OmpA-ST fusjon designed her den C-terminale del av OmpA ble slettet og ST ble smeltet til periplasmically vender N- eller C-termini. Slette periplasmatiske del av OmpA reduserer antall interaksjoner mellom den ytre membranen og peptidoglykan resulterer i membranen destabilisering fører til hyper-blæredannelse ^7. Genomisk OmpA ble opprettholdt i tillegg til rekombinant uttrykte OmpA-ST-konstruksjon for å redusere brutto membran destabilisering.

Protocol

1. Fremstilling av plasmider Forbered et plasmid (f.eks pET22) som inneholder anker protein (OmpA) smeltet til en biorthogonal kobling domene (referert til i denne protokollen som anker-ST), epitop tag (som 6xHis, myc eller flagg koder for rensing og identifikasjon), periplasmatiske lokalisering tag, antibiotikaresistens, og hensiktsmessig replikasjons basert på den valgte bakteriestamme 7. Utdrag plasmid DNA fra natten kulturer ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig DNA kit f?…

Representative Results

Samtidig ekspresjon av to rekombinante proteiner, som er nødvendig for OMV emballasjen strategien beskrevet i denne protokollen, kan oppnås ved en rekke forskjellige veier. Her ble det to vektorsystem utnyttes med kompatible replikasjons og separate induserbare genet kassetter. For ekspresjon av den PTE-SC konstruere et kommersielt plasmid ryggrad (pACY184) ble konstruert for å inkludere et arabinose induserbar gen kassett og en tvilling arginin periplasmatiske lokalisering av lederse…

Discussion

Denne protokollen funksjoner for å demonstrere en representativ rettet emballasjeteknikk der et enzym av interesse blir produsert og pakket inn i OMV av E. coli. Som med mange komplekse teknikker det er flere områder hvor protokollen kan endres for å imøtekomme til bruk i ulike unike applikasjoner, hvorav noen er beskrevet nedenfor. Mens mekanismen for OMV emballasje og enzym innkapsling kan tilpasses spesifikke behov er det flere trinn i denne protokollen som er avgjørende for dens suksess. Den innledende…

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.