Multimodal Kvantitativ Phase Imaging med Digital Holografisk Microscopy Præcist Vurderer tarmbetændelse og Epithelial Sårheling

Summary

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Abstract

Forekomsten af inflammatorisk tarmsygdom, dvs, Crohns sygdom og colitis ulcerosa, steget betydeligt i det seneste årti. Ætiologien for IBD er ukendt og nuværende terapeutiske strategier er baseret på den uspecifikke undertrykkelse af immunsystemet. Udviklingen af ​​behandlinger, der specifikt er målrettet mod tarmbetændelse og epitelial sårheling væsentlig grad kan forbedre forvaltningen af ​​IBD, men dette kræver nøjagtig påvisning af inflammatoriske forandringer. I øjeblikket er potentielle lægemiddelkandidater sædvanligvis evalueret under anvendelse af dyremodeller in vivo eller med cellekultur-baserede teknikker in vitro. Histologisk undersøgelse normalt kræver de celler eller væv af interesse, der skal farves, hvilket kan ændre prøven egenskaber og desuden kan fortolkningen af ​​resultaterne variere fra investigator ekspertise. Digital holografisk mikroskopi (DHM), baseret på påvisning af længden forsinkelse optiske vej, tilladerplet-fri kvantitativ fasekontrast billeddannelse. Dette gør det muligt at underkaste dem en direkte korreleret med absolutte biofysiske parametre. Vi viser, hvordan målingen af ​​ændringer i vævstæthed med DHM, baseret på brydningsindeks måling, kan kvantificere inflammatoriske ændringer, uden farvning, i forskellige lag af colon vævsprøver fra mus og mennesker med colitis. Derudover viser vi kontinuerlig multimodal label-free overvågning af epitelial sårheling in vitro, muligt ved hjælp DHM gennem simpel automatiseret bestemmelse af det sårede område og samtidig bestemmelse af morfologiske parametre såsom tør masse og lagtykkelse på migrerende celler. Afslutningsvis DHM repræsenterer en værdifuld, hidtil ukendt og kvantitativ værktøj til vurdering af tarmbetændelse med absolutte værdier for parametre er muligt, forenkles kvantificering af epitelial sårheling in vitro og har derfor stort potentiale for translationel diagnostisk uSE.

Introduction

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD), dvs., colitis ulcerosa (UC) og Crohns sygdom (CD) er idiopatiske inflammatoriske sygdomme i mavetarmkanalen ^1. Forskning i den underliggende patofysiologi IBD og evalueringen af ​​potentielle nye lægemidler eller nye diagnostiske metoder er især af betydning. I både grundforskning og den kliniske behandling af IBD patienter har tarmslimhinden blive fokus for opmærksomhed ^2,3. Slimhinden betegner en anatomisk grænse, hvor interaktionen mellem kommensale bakterier, epitelceller og forskellige cellulære bestanddele af den intestinale immunsystem iscenesætte gut homeostase ^4,5. I IBD patienter, ukontrolleret og vedvarende tarmbetændelse fører imidlertid til mucosale skade, kan påvises som ulcerationer eller stenose, som endelig kan kulminere i nedbrydning af epitelial barrierefunktion, som i sig selv forværrer lokal inflammation ^6.

<pclass = "jove_content"> Epithelial sårheling er derfor afgørende for epitelial regeneration efter inflammation, men er også et centralt krav til heling af mavesår eller anastomotiske lækage efter gastrointestinal kirurgi ^7. Epithelial sårheling kan simuleres i in vitro sårheling assays og i murine modeller af tarmbetændelse ^8,9. Både in vitro- og in vivo fremgangsmåder har ulemper, som begrænser nøjagtigheden af eksperimentel vurdering. In vitro-assays, som klassiske scratch assays, kræver langvarige farvningsprocedurer eller transfektion med fluorescerende kromoforer. De er ofte begrænset af deres diskontinuerlig overvågning af celleproliferation og migration, der ikke kan automatiseres ^10. In vivo modeller, såsom dextran natriumsulfat (DSS) -induceret colitis, ofte mangler robuste udlæsninger, delvis på grund af den betydelige variation set i laboratoriemarkører, making sådanne markører upassende at evaluere colitis sværhedsgrad ^11,12. Histologisk analyse af den betændte slimhinde, er stadig den mest anvendelig metode til bestemmelse colitis sværhedsgrad men dette, så som in vitro epiteliale sårhelende assays kræver farvning og er afhængig af investigators ekspertise ^13.

Senest digital holografisk mikroskopi (DHM), en variant af kvantitativ fase mikroskopi ^14, blev identificeret som nyttigt redskab til evaluering af epitelial sårheling in vitro og in vivo ^15. DHM tillader vurdering af væv densitet ved måling af optisk vejlængde forsinkelse (OPD) , hvor der er udsigt roman kræftdiagnose ^16-18 og kvantificering af inflammation relateret væv forandringer ^19. Derudover DHM tillader overvågning af cellemorfologi dynamik ved at bestemme celle tykkelse, celle dækket overfladeareal og intracellulære (protein) indhold mængde <sup> 15,20. I in vitro-assays, DHM muliggør også analyse af fysiologiske processer, fx cellulære vandpermeabilitet ved at evaluere ændringer i cellevolumen og tykkelse ^21,22. Desuden kan DHM målinger automatiseres som forhindrer investigator-associeret prøve bias.

Her demonstrerer vi brug af DHM i en musemodel af tarmbetændelse, og gælder også DHM til analyse af humane væv prøver til kvantitativ overvågning af sårheling som en etiket-fri in vitro assay. Først, vi evaluerer inflammatoriske ændringer af forskellige colon væg-lag i colitic mus og vævssnit fra mennesker med IBD. Efter at have beskrevet den kvantitative fase imaging procedure DHM, giver vi detaljerede instruktioner for brug af mikroskop komponenter, udarbejdelse af vævssnit og også beskrive evalueringen af ​​de overtagne fase billeder kvantitative.

Dernæst viser vi, at DHM kan være utilized til kontinuerlig multimodal overvågning af epitelial sårheling in vitro, og beskrive den analyse af cellulære egenskaber som celle lagtykkelse, tørvægt og cellulære volumen giver indsigt i narkotika-induceret og fysiologisk celle forandringer.

Protocol

Alle eksperimenter dyr blev godkendt af den regionale etiske komité (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Tyskland) i henhold til den tyske Animal Protection Law. Den lokale etiske udvalg fra University of Münster godkendt brugen af ​​humane væv til histologisk og mikroskop analyse. 1. Dyr og materialer Brug kvindelig eller mandlig mus af den krævede DSS-følsom stamme, der vejer 20 til 25 g, og huset i henhold til lokal lovgivning dyr pleje. Giv sær…

Representative Results

Typisk Opsætning til DHM Imaging for Digital Holografisk Microscopy (DHM) For at udføre lyse felt billedbehandling og kvantitativ DHM fase kontrast imaging, vi anvendte et omvendt mikroskop som vist i figur 1 B. Systemet blev modificeret ved at fastgøre en DHM modul, som tidligere beskrevet 25. Digitale hologrammer blev genereret ved belysning af…

Discussion

Vi viser, at DHM giver nøjagtig vurdering af histologiske skader i murine colitis modeller og prøver menneskelige colon væv ex vivo. Desuden er vi vist DHM kan løbende overvåge epitelial sårheling og samtidig give multimodal information om cellulære ændringer. I DHM, er genopbygningen af digitalt tilfangetagne hologrammer udføres numerisk ^32. Derfor, i sammenligning med lysfeltmikroskopi, Zernike fasekontrast og differentieret interferens kontrast mikroskopi, DHM giver kvantitativ fasekontra…

Materials

Reagents
Azoxymethane (AOM)	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	A5486
Cell Culture Flask	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	658170
Costar Stripette	Corning Inc., New York, USA	4488
Dextran sulphate sodium (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
DMEM/Ham´s F12	PAA Laboratories – Pasching – Austria	E15-813
EGF	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Falcon Tube 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070
Isopentane (2- Methylbutane)	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	M32631-1L
Methylene blue	Merck, Darmstadt, Germany	1159430025
Mitomycin C	Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany	M4287
Microscope Slides	G. Menzel, Braunschweig, Germany	J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583
Pen/Strep/Amphotericin B	Lonza, Verviers, Belgium	1558
Phosphate buffered saline, PBS	Lonza, Verviers, Belgium	4629
RPMI 1640	Lonza, Verviers, Belgium	3626
Sodium Chloride 0,9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
Standard diet	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Trypsin EDTA	Lonza, Verviers, Belgium	7815
Vitro – Clud	R. Langenbrinck, Teningen, Germany	04-0002
µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high	ibidi GmbH, Munich, Germany	81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert	ibidi GmbH, Munich, Germany	80050
Equipment
MICROM HM550	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA	46320
Digital holographic microscope
Component	Model	Company
Inverted Microscope	iMIC	Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser	Compass 315M	Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens	Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3	Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera	DMK 41BF02	The Imaging Source, Bremen, Germany