Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.
Forekomsten af inflammatorisk tarmsygdom, dvs, Crohns sygdom og colitis ulcerosa, steget betydeligt i det seneste årti. Ætiologien for IBD er ukendt og nuværende terapeutiske strategier er baseret på den uspecifikke undertrykkelse af immunsystemet. Udviklingen af behandlinger, der specifikt er målrettet mod tarmbetændelse og epitelial sårheling væsentlig grad kan forbedre forvaltningen af IBD, men dette kræver nøjagtig påvisning af inflammatoriske forandringer. I øjeblikket er potentielle lægemiddelkandidater sædvanligvis evalueret under anvendelse af dyremodeller in vivo eller med cellekultur-baserede teknikker in vitro. Histologisk undersøgelse normalt kræver de celler eller væv af interesse, der skal farves, hvilket kan ændre prøven egenskaber og desuden kan fortolkningen af resultaterne variere fra investigator ekspertise. Digital holografisk mikroskopi (DHM), baseret på påvisning af længden forsinkelse optiske vej, tilladerplet-fri kvantitativ fasekontrast billeddannelse. Dette gør det muligt at underkaste dem en direkte korreleret med absolutte biofysiske parametre. Vi viser, hvordan målingen af ændringer i vævstæthed med DHM, baseret på brydningsindeks måling, kan kvantificere inflammatoriske ændringer, uden farvning, i forskellige lag af colon vævsprøver fra mus og mennesker med colitis. Derudover viser vi kontinuerlig multimodal label-free overvågning af epitelial sårheling in vitro, muligt ved hjælp DHM gennem simpel automatiseret bestemmelse af det sårede område og samtidig bestemmelse af morfologiske parametre såsom tør masse og lagtykkelse på migrerende celler. Afslutningsvis DHM repræsenterer en værdifuld, hidtil ukendt og kvantitativ værktøj til vurdering af tarmbetændelse med absolutte værdier for parametre er muligt, forenkles kvantificering af epitelial sårheling in vitro og har derfor stort potentiale for translationel diagnostisk uSE.
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD), dvs., colitis ulcerosa (UC) og Crohns sygdom (CD) er idiopatiske inflammatoriske sygdomme i mavetarmkanalen 1. Forskning i den underliggende patofysiologi IBD og evalueringen af potentielle nye lægemidler eller nye diagnostiske metoder er især af betydning. I både grundforskning og den kliniske behandling af IBD patienter har tarmslimhinden blive fokus for opmærksomhed 2,3. Slimhinden betegner en anatomisk grænse, hvor interaktionen mellem kommensale bakterier, epitelceller og forskellige cellulære bestanddele af den intestinale immunsystem iscenesætte gut homeostase 4,5. I IBD patienter, ukontrolleret og vedvarende tarmbetændelse fører imidlertid til mucosale skade, kan påvises som ulcerationer eller stenose, som endelig kan kulminere i nedbrydning af epitelial barrierefunktion, som i sig selv forværrer lokal inflammation 6.
<pclass = "jove_content"> Epithelial sårheling er derfor afgørende for epitelial regeneration efter inflammation, men er også et centralt krav til heling af mavesår eller anastomotiske lækage efter gastrointestinal kirurgi 7. Epithelial sårheling kan simuleres i in vitro sårheling assays og i murine modeller af tarmbetændelse 8,9. Både in vitro- og in vivo fremgangsmåder har ulemper, som begrænser nøjagtigheden af eksperimentel vurdering. In vitro-assays, som klassiske scratch assays, kræver langvarige farvningsprocedurer eller transfektion med fluorescerende kromoforer. De er ofte begrænset af deres diskontinuerlig overvågning af celleproliferation og migration, der ikke kan automatiseres 10. In vivo modeller, såsom dextran natriumsulfat (DSS) -induceret colitis, ofte mangler robuste udlæsninger, delvis på grund af den betydelige variation set i laboratoriemarkører, making sådanne markører upassende at evaluere colitis sværhedsgrad 11,12. Histologisk analyse af den betændte slimhinde, er stadig den mest anvendelig metode til bestemmelse colitis sværhedsgrad men dette, så som in vitro epiteliale sårhelende assays kræver farvning og er afhængig af investigators ekspertise 13.Senest digital holografisk mikroskopi (DHM), en variant af kvantitativ fase mikroskopi 14, blev identificeret som nyttigt redskab til evaluering af epitelial sårheling in vitro og in vivo 15. DHM tillader vurdering af væv densitet ved måling af optisk vejlængde forsinkelse (OPD) , hvor der er udsigt roman kræftdiagnose 16-18 og kvantificering af inflammation relateret væv forandringer 19. Derudover DHM tillader overvågning af cellemorfologi dynamik ved at bestemme celle tykkelse, celle dækket overfladeareal og intracellulære (protein) indhold mængde <sup> 15,20. I in vitro-assays, DHM muliggør også analyse af fysiologiske processer, fx cellulære vandpermeabilitet ved at evaluere ændringer i cellevolumen og tykkelse 21,22. Desuden kan DHM målinger automatiseres som forhindrer investigator-associeret prøve bias.
Her demonstrerer vi brug af DHM i en musemodel af tarmbetændelse, og gælder også DHM til analyse af humane væv prøver til kvantitativ overvågning af sårheling som en etiket-fri in vitro assay. Først, vi evaluerer inflammatoriske ændringer af forskellige colon væg-lag i colitic mus og vævssnit fra mennesker med IBD. Efter at have beskrevet den kvantitative fase imaging procedure DHM, giver vi detaljerede instruktioner for brug af mikroskop komponenter, udarbejdelse af vævssnit og også beskrive evalueringen af de overtagne fase billeder kvantitative.
Dernæst viser vi, at DHM kan være utilized til kontinuerlig multimodal overvågning af epitelial sårheling in vitro, og beskrive den analyse af cellulære egenskaber som celle lagtykkelse, tørvægt og cellulære volumen giver indsigt i narkotika-induceret og fysiologisk celle forandringer.
Vi viser, at DHM giver nøjagtig vurdering af histologiske skader i murine colitis modeller og prøver menneskelige colon væv ex vivo. Desuden er vi vist DHM kan løbende overvåge epitelial sårheling og samtidig give multimodal information om cellulære ændringer. I DHM, er genopbygningen af digitalt tilfangetagne hologrammer udføres numerisk 32. Derfor, i sammenligning med lysfeltmikroskopi, Zernike fasekontrast og differentieret interferens kontrast mikroskopi, DHM giver kvantitativ fasekontra…
The authors have nothing to disclose.
We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.
Reagents | ||
Azoxymethane (AOM) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 |
Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 |
Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 |
Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 |
DMEM/Ham´s F12 | PAA Laboratories – Pasching – Austria | E15-813 |
EGF | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 |
Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
Isopentane (2- Methylbutane) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L |
Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 |
Mitomycin C | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 |
Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ |
O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 |
Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 |
Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 |
RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 |
Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 |
Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 |
Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 |
Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 |
µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 |
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 |
Equipment | ||
MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 |
Digital holographic microscope | ||
Component | Model | Company |
Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany |
Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany |
Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany |
CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |