Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

المتعدد الوسائط الكمي المرحلة التصوير مع الرقمي المجسم المجهر يقيم بدقة شفاء المعوية والتهاب الجرح طلائي

Published: September 13, 2016 doi: 10.3791/54460
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, *3, *1
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld
* These authors contributed equally

Abstract

الإصابة بأمراض الأمعاء الالتهابية، أي مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، وزادت بشكل كبير خلال العقد الماضي. مسببات مرض التهاب الأمعاء لا يزال غير معروف، وتستند الاستراتيجيات العلاجية الحالية بشأن قمع غير محدد من الجهاز المناعي. تطوير العلاجات التي تستهدف على وجه التحديد التهاب الأمعاء والتئام الجروح الظهارية يمكن أن يحسن بشكل ملحوظ إدارة مرض التهاب الأمعاء، ولكن هذا يتطلب كشف دقيق للتغيرات التهابية. حاليا، يتم عادة تقييم المرشحين المحتملين المخدرات باستخدام النماذج الحيوانية في الجسم الحي أو مع التقنيات التي تعتمد زراعة الخلايا في المختبر. وعادة ما يتطلب الفحص النسيجي لخلايا أو أنسجة من مصلحة لتكون ملطخة، الأمر الذي قد يغير خصائص العينة وعلاوة على ذلك، فإن تفسير النتائج يمكن أن تختلف من الخبرة محقق. المجهر الثلاثية الأبعاد الرقمية (DHM)، استنادا إلى الكشف عن بصري مسار تأخير طول، يسمحخالية من وصمة عار مرحلة الكمية النقيض من التصوير. وهذا يسمح النتائج إلى أن تكون مرتبطة مباشرة مع المعلمات الفيزيائية الحيوية المطلقة. نحن لشرح كيفية قياس التغيرات في كثافة الأنسجة مع DHM، استنادا إلى قياس معامل الانكسار، ويمكن تحديد حجم التغيرات الالتهابية، دون تلطيخ، في طبقات مختلفة من العينات انسجة القولون من الفئران والبشر يعانون من التهاب القولون. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر مراقبة التسمية خالية المتعدد الوسائط المستمر لالتئام الجروح الظهارية في المختبر، من الممكن استخدام DHM من خلال تحديد الآلية بسيطة من منطقة الجرحى وتحديد وقت واحد من المعلمات المورفولوجية مثل الكتلة الجافة وسمك طبقة من الخلايا المهاجرة. في الختام، DHM يمثل قيمة والرواية وأداة الكمية لتقييم التهاب الأمعاء مع القيم المطلقة للمعلمات الممكنة، وتحديد مبسط لالتئام الجروح الظهارية في المختبر، وبالتالي لديها امكانات عالية لأجلك التشخيص متعديةحد ذاتها.

Introduction

مرض التهاب الأمعاء (IBD)، أي التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) والاضطرابات الالتهابية مجهول السبب من الجهاز الهضمي 1. البحث في الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء مرض التهاب الأمعاء وتقييم الأدوية الجديدة المحتملة أو نهج التشخيص الرواية بشكل خاص من حيث الأهمية. في كل من البحوث الأساسية والتدبير السريري للمرضى مرض التهاب الأمعاء، وأصبح الغشاء المخاطي في الأمعاء محط اهتمام 2،3. يمثل الغشاء المخاطي على الحدود التشريحية، التي التفاعل بين البكتيريا المتعايشة، الخلايا الظهارية والمكونات الخلوية المختلفة للنظام المناعة المعوية تنسق الأمعاء التوازن 4،5. ومع ذلك، في المرضى الذين يعانون مرض التهاب الأمعاء، غير المنضبط واستمرار التهاب الأمعاء يؤدي إلى المخاطية الضرر، كشفها كما تقرحات أو تضيق، والتي يمكن أن تتوج في النهاية في انهيار وظيفة حاجز الظهارية، والذي في حد ذاته يزيد من تفاقم التهاب المحلي 6.

7. الجرح الظهارية الشفاء يمكن محاكاة في المختبر في التئام الجروح المقايسات وفي نماذج الفئران من التهاب الأمعاء 8،9. على حد سواء في التجارب المختبرية والحية النهج على مساوئ، التي تحد من دقة التقييم التجريبي وفي فحوصات المختبر، مثل فحوصات الصفر الكلاسيكية، تتطلب إجراءات تلطيخ مطولة أو ترنسفكأيشن مع حاملات الفلورسنت. غالبا ما تكون محدودة من قبل مراقبة متقطع على تكاثر الخلايا والهجرة التي لا يمكن أن يكون آليا (10). وفي النماذج الحية، مثل كبريتات ديكستران الصوديوم (DSS) والتهاب القولون -induced، وكثيرا ما تفتقر قوية للقراءة الرافضة، ويرجع ذلك جزئيا إلى تفاوت كبير ينظر في علامات المختبر، يا أماهملك هذه علامات غير ملائمة لتقييم التهاب القولون شدة 11،12. تحليل النسيجي من الغشاء المخاطي الملتهبة لا يزال حاليا الأكثر ملائمة لتحديد التهاب القولون شدة ولكن هذا، كما هو الحال في المختبر التئام الجروح المقايسات الظهارية، يتطلب تلطيخ ويعتمد على الخبرات المحقق 13.

وقد تم تحديد المجهر الثلاثية الأبعاد الرقمية مؤخرا (DHM)، وهو البديل من الكمية المرحلة المجهري 14، كأداة مفيدة لتقييم الظهارية التئام الجروح في التجارب المختبرية والحية 15. يسمح DHM تقييم كثافة الأنسجة عن طريق قياس مسار بصري طول تأخير (العيادات الخارجية) ، الذي تشخيص احتمالات سرطان رواية 16-18 وتقدير من التهاب ذات الصلة التعديلات الأنسجة 19. بالإضافة إلى ذلك، DHM يسمح رصد ديناميات خلية التشكل من خلال تحديد سمك خلية، خلية غطت مساحة السطح وداخل الخلايا (البروتين) كمية المحتوى في المختبر، كما يتيح DHM تحليل العمليات الفيزيولوجية، على سبيل المثال، نفاذية المياه الخلوية من خلال تقييم التغيرات في حجم الخلية وسمك 21،22. وعلاوة على ذلك، والقياسات DHM يمكن أن يكون آليا والذي يمنع المرتبطة محقق عينة التحيز.

هنا، ونحن لشرح استخدام DHM في نموذج الفئران من التهاب الأمعاء، وأيضا تطبيق DHM لتحليل عينات الأنسجة البشرية الرصد الكمي من التئام الجروح كما في الفحص المختبري خالية من التسمية. أولا، نحن تقييم التغيرات الالتهابية المختلفة القولون الجدار متعدد الطبقات في الفئران colitic وأقسام الأنسجة من البشر مع مرض التهاب الأمعاء. بعد أن وصف مرحلة الكمية إجراء التصوير DHM، ونحن نقدم تعليمات مفصلة لاستخدام مكونات المجهر، وإعداد أقسام الأنسجة، وكذلك وصف تقييم الصور المرحلة الكمية المكتسبة.

بعد ذلك، وتبين لنا أن DHM يمكن أن يكون التهاب المسالك البوليةlized لرصد المتعدد الوسائط المستمر للالظهارية التئام الجروح في المختبر، ووصف تحليل الخصائص الخلوية مثل سمك طبقة الخلايا والكتلة الجافة وحجم الخلوي يعطي نظرة ثاقبة المخدرات التي يسببها وخلية الفسيولوجية التعديلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة الإقليمية الأخلاق (وLandesamt FÜR الناطور، UMWELT اوند Verbraucherschutz، LANUV، ألمانيا) وفقا لقانون حماية الحيوان الألمانية. وافقت لجنة الاخلاق المحلية للجامعة مونستر استخدام الأنسجة البشرية للتحليل النسيجي والمجهر.

1. الحيوانات والمواد

  1. استخدام النساء أو ذكور الفئران من سلالة DSS عرضة المطلوبة التي تزن 20 إلى 25 غرام، والمنزل، وفقا للتشريعات الرعاية للحيوانات المحلية. تقديم طعام خاص للقوارض وتعقيمها شرب المياه libitum الإعلانية.
  2. حمل التهاب القولون الحاد مفاجآت صيف دبي التي تدير 3٪ ث / ت ديكستران سلفات الصوديوم (DSS، الوزن الجزيئي: 36،000-50،000 دا) في مياه الحنفية تعقيمها لمدة 5 أيام.
    ملاحظة: قوة من مفاجآت صيف دبي هي اختلافا كبيرا تبعا الصانع ودفعة واحدة. اختبر معلوماتك المقدمة المورد مفاجآت صيف دبي لأول مرة لتحريض نشاط المرض، والتي داإيلي وزن الجسم هو مؤشر موثوق به وموضوعي.
  3. لتقييم النسيجي لعينات أنسجة القولون، الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 نفخ (أو كما هو محدد من قبل الإرشادات الوطنية والمؤسسية) في نهاية التجربة.

2. إعداد تجريبي لDSS-التهاب القولون وفي المختبر الجروح فحوصات

  1. زراعة الخلايا وإنشاء فحص التئام الجروح.
    1. تنمو كاتشو-2 الخلايا في الرطوبة 95٪ و 5٪ CO 2 بيئة عند 37 درجة مئوية. استخدام RPMI المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
    2. البذور كاتشو-2 الخلايا في كثافة 4 × 10 5 خلية / سم 2 على 35 مم أطباق بتري مع ارتفاع ثقافة إدراج (انظر الشكل 4A).
      ملاحظة: إدراج يولد منطقتين الخلية مغطاة التي يتم فصلها مع مساحة حرة خلية محددة تمثل منطقة الجرحى ليتم تحليلها.
    3. تغيير المتوسطة بعد يومين من seedinز. أداء بواسطة الشفط أولا المتوسطة المتبقية مع الحطام الخلية باستخدام ماصة أوتوماتيكية، وشطف مع 100 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة جديدة RPMI المتوسطة أو المتوسطة حرم المصل.
    4. ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة في المتوسط ​​حرمان المصل (0.1٪ FBS) تستكمل مع 20 نانوغرام EGF / المصل مل أو 2 ميكروغرام ميتوميسين ج / المصل مل للكشف عن تغيرات في السلوك الجرح الشفاء. إضافة المتوسطة RPMI الطبيعي للسيطرة على الخلايا لمدة 24 ساعة.
    5. بعد 24 ساعة من الثقافة، وإزالة وتجاهل إدراج الثقافة كما هو موضح في الخطوة 3.4 وأداء DHM.
  2. تحريض التهاب القولون الحاد مفاجآت صيف دبي
    1. حل 3 غرام من مفاجآت صيف دبي في 100 مل من الماء تعقيمها للحصول على 3٪ (ث / ت) حل مفاجآت صيف دبي. توفير هذا الحل في مكان المياه الصالحة للشرب لالفئران بالمال وبالشهرة أيضا الإعلان لمدة 7 أيام. احسب 5 مل من DSS-حل في الماوس / يوم. توفير المياه تعقيمها دون مفاجآت صيف دبي للالسيطرة على الفئران libitum الإعلانية.
  3. إعداد أقسام cryostatic من الفئران والقولون البشري
    1. الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 نفخ في نهاية التجربة.
    2. تشريح البطن الحيوانات عن طريق فتح البطن 23. إزالة القولون كله بعناية باستخدام الملقط وقطع في نهاية اللفائفية والمستقيم باستخدام مقص جراحي. قطع القولون مع مقص طوليا من أعوري إلى نهاية المستقيم وفتح القولون. إزالة جميع البراز من العينة باستخدام الملقط تليها الغسيل مع برنامج تلفزيوني (24).
    3. إعداد القوائم السويسرية تشمير القولون كله مع القطن برعم طوليا من أعوري إلى نهاية المستقيم مع الغشاء المخاطي منحنية إلى الداخل. تضمين عينات القولون في أفضل درجة حرارة القطع (أكتوبر) مركب وأظل في المجمد -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    4. تضمين انسجة القولون الإنسان من عينة جراحية في قطع الأمثل درجة حرارة أكتوبر المجمع وأظل في المجمد -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
    5. أقسام قطع من 7 ميكرون سمك العينات جزءا لا يتجزأ من أكتوبر-مجمع مع مساعدة من cryotoلي فقط قبل الفحص.
      ملاحظة: سمك العينة الأمثل يعتمد على المثابرة وخصائص نثر من نوع النسيج تحت التحقيق. لوصف التجارب باستخدام أنسجة القولون، شريحة سمك> 10 ميكرون سبب زيادة كبيرة في الضوضاء بسبب تشتت الضوء في الكمية على النقيض من الصور المرحلة DHM، بينما عينات من سمك <5 ميكرون تظهر أكثر عرضة للضرر الناجم عن القطع الأثرية من عملية التقطيع البرد.
    6. نقل المقاطع إلى شريحة زجاجية وجوه الناقل.

3. المعدات التقنية، والبرمجيات وإجراءات اقتناء وتقييم الصور المجسمة الرقمية

  1. المجهر المجسم الرقمي للخلية الكمية والتصوير الأنسجة
    1. استخدام ماخ زيندر الرقمية نظام المجهر الثلاثية الأبعاد المحور خارج ليعيش خلية التصوير 25، كما هو مبين في الشكل 1. تأكد من أن يتم تجهيز المجهر مع10X عدسة المجهر، مرحلة المجهر مع حامل لالشرائح الناقل جسم زجاجي وأطباق بتري التي يبلغ قطرها 35 ملم، وغرفة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية عند 37 درجة مئوية وبرامج للمرحلة الكمية التصوير 25.
      ملاحظة: على سبيل المثال، كما هو موضح في كمبر وآخرون 26 و Langehanenberg وآخرون (27)..
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدام نظام مماثل قادر على أداء مشرق المجهري الميدان والكمي مرحلة التصوير من الخلايا الحية والشرائح تشريح الأنسجة.
    2. عدسة المجهر نظيفة والمكثف مع ورقة تنظيف العدسة وعامل تنظيف (على سبيل المثال، والإيثانول) على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة للمجهر لإزالة الغبار أو التلوث الأخرى.
    3. بدء برنامج الحصول على صورة المجهر DHM، حدد "مشرق الميدان" واسطة التصوير والتبديل "على" إضاءة الضوء الأبيض. ضمان كولر illuminأوجه من العينة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة المجهر مع مراعاة العينة في نافذة التصوير المباشر لبرنامج الحصول على الصور (بدلا من برنامج الحصول على الصور القياسية يمكن أن تستخدم في هذه الخطوة).
      ملاحظة: يجب توزيع كثافة صورة متجانس في مجال الرؤية، وينبغي وضع العينة لا تتحرك خلال إعادة تركيز بصري مع محرك تركيز المجهر.
    4. حدد "DHM" وضع التصوير، وتحويل "قبالة" إضاءة الضوء الأبيض والتبديل "على" ضوء الليزر. تأكد من أن الإضاءة مع ضوء الليزر متجانسة (أي أن شدة الضوء وتوزع متجانس في إطار التصوير المباشر لبرنامج الحصول على التصوير المجهر DHM) ونلاحظ أن خارج المحور الناقل نمط التداخل هامش يبدو مع تباين كاف في الصور التي تم التقاطها (الصور المجسمة الرقمية).
  2. إعداد المقاطع ناظم البرد للتصويرمع DHM
    1. خذ (قسم ناظم البرد على الناقل جسم زجاجي، سمك: 7 ميكرون، كما هو موضح في 2.3) عينة من الثلاجة. تذويب العينة لمدة 5 دقائق على RT والغلاف الجوي العادي.
    2. إضافة 50-100 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وتضمين المتوسطة على قسم الأنسجة باستخدام ماصة حتى يتم تغطيتها بالكامل مع العازلة. تغطية عينة مع كوب نظيف انزلاق الغطاء (سمك الزجاج 170 ميكرون).
      ملاحظة: الإفراط في تجفيف يمكن أن تحدث تغييرات كبيرة في معامل الانكسار وخصائص نثر من العينة.
    3. تأكد من أن الجزء السفلي من الناقل الزجاج وانزلاق الغطاء يتم تنظيف من الغبار والتلوث الأخرى التي ربما تتسبب في تشتت الضوء. العينة مستعدة للتحقيق مع المجهر مشرق الميدان وDHM.
  3. مرحلة التصوير الكمي للأقسام الأنسجة مع DHM
    1. التبديل على المجهر المجسم الرقمي، واختيار عدسة المجهر 10X للتصوير. بدء طبرنامج الحصول على بركه المجهر DHM وتحديد وضع التصوير ملف مشرق.
    2. ضع الشريحة الأنسجة كما هو موضح في 2) في حامل المجهر الشريحة، مع انزلاق الغطاء تواجه الهدف المجهر.
    3. التبديل "على" إضاءة حقل مشرق من المجهر DHM. ضع عينة مع المرحلة المجهر والتأكد من أن منطقة الأنسجة من الاهتمام مرئيا في إطار المراقبة الحية. تحسين حدة الصورة باستخدام محرك تركيز المجهر.
      ملاحظة: بالإضافة إلى مجال الاهتمام، كما ينبغي أن تكون مساحة الشريحة دون الأنسجة الموجودة في مجال الرؤية.
    4. التقاط صورة حقل مشرق من العينة التي تركز بشدة باستخدام برنامج الحصول على الصور.
    5. حدد "DHM" وضع التصوير، وتحويل "قبالة" إضاءة الضوء الأبيض وتحويل "على" إضاءة ضوء الليزر. حدد "وقت التعرض" لتسجيل ثلاثية الأبعاد أقل من 3 ميللي ثانية، نلاحظ أن holographic خارج المحور تظهر هامش تدخل مع تباين كاف في نافذة التصوير المباشر لبرنامج الحصول على التصوير والتقاط صورة ثلاثية الأبعاد الرقمية.
    6. كرر الخطوات من 3.3.3 - 3.3.5 حتى تم تسجيل عدد كاف من الصور الحقل مشرق والصور ثلاثية الأبعاد الرقمية المناطق عينة مختلفة. اكتساب صورة ثلاثية الأبعاد اكتمال الآن.
  4. إعداد المقايسات التئام الجروح للتصوير DHM
    1. التبديل على بيتري غرفة طبق التدفئة المجهر DHM حول 1-3 ساعة قبل بدء التجربة لضمان ظروف درجة حرارة ثابتة خلال القياسات DHM.
    2. إعداد طاولة العمل مع المعدات المطلوبة (طبق بيتري لالتئام الجروح الفحص الموضح في 2.3): الماصات، ملاقط، غطاء زجاجي لطبق بيتري، 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) مخزنة مستنبت الخلية مع الفسيولوجية درجة الحرارة (37 درجة مئوية) لإعداد العينات في بيئة معقمة.
      ملاحظة: 3.
    3. إزالة الغطاء البلاستيكي من طبق بيتري وإزالة مستنبت الخلية مع ماصة. إزالة إدراج من طبق بيتري أسفل باستخدام الملقط.
    4. تغسل العينة 1-2 مرات مع 1 مل HEPES مخزنة خلية مستنبت لإزالة الخلايا الميتة وتبقى المكونات الخلوية (على سبيل المثال، المصل) في منطقة الجرح. إضافة 2 مل HEPES مخزنة مستنبت الخلية وسقف طبق بيتري مع غطاء زجاجي.
    5. تأكد من أن غطاء زجاجي وطبق بيتري أسفل تم تنظيفها من الغبار والتلوث الأخرى. عينة جاهز للوقت رصد مرور مع DHM.
  5. مراقبة المتعدد الوسائط المستمر لالتئام الجروح في المختبر مع DHM
    1. التبديل على بيتري غرفة طبق التدفئة المجهر DHM حوالي 1 - 3 ساعات قبلبدء التجربة لضمان ظروف درجة حرارة ثابتة خلال القياسات DHM.
    2. التبديل "على" المجهر المجسم الرقمي، حدد عدسة 10X المجهر للتصوير. بدء برنامج الحصول على صورة المجهر DHM وحدد "مشرق الميدان" وضع التصوير. تأكد من أن غرفة التدفئة للطبق بتري يعمل درجة حرارة الفسيولوجية (37 درجة مئوية).
    3. وضع طبق بتري مع التئام الجروح الفحص، أعد كما هو موضح في 4)، في غرفة التدفئة المجهر DHM.
    4. تحديد وضع التصوير مشرق الميدان ووضع عينة مع مرحلة المجهر مع مراعاة أنه في إطار الرصد المباشر لبرنامج الحصول على صورة المجهر DHM. نلاحظ أن المنطقة المرغوبة من العينة يبدو ركز بشدة تحت إضاءة الضوء الأبيض.
    5. التقط صورا مشرقة مجال من المجالات المختلفة للعينة (منطقة الجرح والمناطق المحيطة بها مع خلايا متكدسة) تحت أبيضالإضاءة الخفيفة مع البرنامج الحصول على صورة وثيقة المظهر، وكثافة الخلايا والتجانس.
    6. حدد "مشرق الميدان" واسطة التصوير المجهر DHM. اختيار منطقة الجرح مناسبة تحت إضاءة الضوء الأبيض في إطار مراقبة حية مع برنامج الحصول على صورة المجهر DHM. ضمان منطقة الجرح خالية من الخلايا الميتة وبقايا أي مصل، وضمان أن تشمل كلا الجانبين على طبقة الخلايا متجانسة واحدة، ويفضل مع الحدود على التوالي.
    7. التقاط صورة الضوء الأبيض من منطقة الجرح الأولية في مشرق وضع التصوير الميدان مع البرنامج الحصول على صورة المجهر DHM.
    8. تحويل "قبالة" الضوء الأبيض الإضاءة، وحدد "DHM" الوضع والتحول "على" إضاءة الليزر. تحديد وقت التعرض لأقل من 3 مللي ثانية للصورة ثلاثية الأبعاد تسجيل (نلاحظ أن المجسم خارج المحور تظهر هامش تدخل مع تباين كاف في نافذة التصوير المباشر لبرنامج الحصول على صورة رانه DHM المجهر) والتقاط صورة ثلاثية الأبعاد الرقمية.
    9. التقاط صورة ثلاثية الأبعاد العينة في وضع DHM مع البرنامج الحصول على الصور وإعادة بناء صورة المرحلة الكمية مع برنامج اعادة اعمار المجهر DHM من أجل التحقق من جودة الصورة.
    10. حدد وقتا تأخير مناسبة (على سبيل المثال، 3-5 دقيقة) عن الوقت الفاصل بين الهولوغرام الحيازة مع برنامج الحصول على صورة المجهر DHM.
    11. تحديد وضع اكتساب الوقت الفاصل بين البرنامج الحصول على الصور التي مضاءة العينة فقط مع ضوء الليزر خلال اكتساب صورة ثلاثية الأبعاد.
    12. بدء مراقبة DHM الوقت الفاصل بين الفحص التئام الجروح.
    13. وقف شراء الوقت الفاصل بعد وقت المقصود، تحديد وضع التصوير مشرق الميدان وتوثيق ظهور النهائي للعينة تحت التصوير الضوء الأبيض.
  6. إعادة بناء الصور المجسمة الرقمية من أنسجة تشريح وتحديد متوسط ​​معامل الانكسار كمعلمة لتحديدكثافة الأنسجة
    1. إعادة بناء الصور المرحلة كمية من الصور المجسمة الرقمية الأنسجة تشريح مع برنامج المجهر DHM، على سبيل المثال، كما هو موضح في كمبر وآخرون. 26 وLangehanenberg وآخرون. 27.
    2. تحديد متوسط ​​النقيض من المرحلة Δφ في طبقات الأنسجة المختلفة (ظهارة، تحت المخاطية، سدى) في المناطق المختارة بشكل مناسب المصالح (رويس) 19.
    3. تحديد معامل الانكسار للوسط تضمين باستخدام الإنكسار أو بدلا من ذلك باستخدام قيمة مناسبة من الأدب. (قيم معامل الانكسار وسائل الإعلام نموذجي التضمين: ن الماء = 1.334 28، ن الفوسفات المالحة (PBS) = 1.337 29، ن مستنبت الخلية = 1،337-1،339 29،30).
    4. حساب مؤشرات الانكسار من طبقات الأنسجة المختلفة من متوسط ​​النقيض من المرحلة قيم 19
      المعادلة 1 ملاحظة: في المعادلة. 1 λ هو الطول الموجي للضوء الليزر (هنا: λ = 532 نانومتر)، د سمك الأنسجة تشريح (هنا: 7 ميكرون)، ون المتوسطة هو مؤشر الانكسار من الوسط تضمينها (هنا: ن المتوسطة = ن برنامج تلفزيوني = 1.337، تحدده آبي-الانكسار).
  7. إعادة بناء وتقييم الصور المجسمة الرقمية من الوقت الفاصل بين التئام الجروح الملاحظة سلسلة
    1. إعادة بناء الصور المرحلة كمية من الوقت سلسلة انقضاء صورة ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها خلال الملاحظة التئام الجروح مع البرنامج المجهر DHM 26،27.
    2. تطبيع كل سلسلة من الصور المرحلة الكمية إلى صورة مع أقصى النقيض من المرحلة.
    3. تحديد منطقة S ج التي يتم تغطيتها من قبل الخلايا في كمية الصور المرحلة DHM التي كتبها تجزئة الصور، التي يمكن أن تكون فيشكلت باستخدام البرمجيات الحرة خلية التعريف (www.cellprofiler.org 31).
    4. حساب متوسط ​​النقيض من المرحلة الخلايا خلية Δφ في منطقة S ج.
    5. استرداد الخلوي DM كتلة جافة من الخلية Δφ متوسط ​​مرحلة التباين في منطقة S ج 15
      المعادلة 2 (2)
      ملاحظة: في المعادلة 2 DM يدل على وزن جاف الخلوية، تقدم S ج المنطقة التي تحتلها الخلايا وα = 0.002 م 2 / كجم.
    6. تحديد يتجزأ الخلوية الانكسار خلية مؤشر ن ومعامل الانكسار للزراعة الخلايا المتوسطة ن المتوسطة. تحديد خلية ن منفصل تجريبيا من الخلايا مع وقف التنفيذ كما هو موضح في 30 و قياس المتوسطة ن مع الإنكسار. ألترنانسبيا استخدام قيم الأدب لن الخلية 30 و ن المتوسط ​​29،30.
    7. حساب متوسط ​​سمك خلية د خلية من λ، خلية Δφ، ن الخلية ون المتوسط ​​26،32
      المعادلة 3 (3)
      ملاحظة: في المعادلة. 3 الخلية المعلمة د هو متوسط ​​سمك خلية، λ يدل على الطول الموجي ضوء ضوء الليزر، خلية Δφ يدل على متوسط ​​المرحلة النقيض من ذلك، ون الخلية ون المتوسطة هي معامل الانكسار الخلوي لا يتجزأ ومعامل الانكسار من الوسط المحيط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إعداد نموذجي لDHM التصوير لالرقمي المجسم المجهري (DHM)

لإجراء التصوير مشرق الميدان والكمي DHM التصوير مرحلة النقيض من ذلك، طبقنا مجهر مقلوب كما هو مبين في الشكل 1 ب. تم تعديل النظام عن طريق ربط وحدة DHM، كما هو موضح سابقا 25. تم إنشاء الصور المجسمة الرقمية من خلال إضاءة العينة مع ضوء بدون تاريخ تضاعف تردد: YAG الليزر λ = 532 نانومتر) في التكوين ماخ زيندر (الشكل 1). وقد تم تحليل الأنسجة تشريح الجسم الحي السابقين على الشرائح الناقل الزجاج. وقد لوحظت يعيشون مزارع الخلايا في أطباق بتري خاصة لمراقبة التئام الجروح كما هو مبين في الشكل 1 C. تم تصوير العينات في الإضاءة انتقال عبر 10X ميلعدسة croscope (NA = 0.3) وعدسة أنبوب. تم استخدام كاميرا الجهاز المسؤول عن جانب لتسجيل أنماط التدخل (الرقمية المجسمة خارج المحور) التي تم إنشاؤها عن طريق إضافة صورة عينة (موجة الجسم) مع موجة إشارة مائلة قليلا. تم بناؤها في الصور المجسمة رقميا من المرحلة المكانية تتحول إعادة الإعمار في تركيبة مع اختياري الثلاثية الأبعاد autofocusing 26،33.

تقييم يسببها DSS-الفئران التهاب القولون التي كتبها DHM

وكان المستحث التهاب القولون الحاد في الفئران عن طريق إدارة من 3٪ ث / ت ديكستران سلفات الصوديوم (DSS) في مياه الشرب لمدة 5 أيام. وأعقب مظهر من مظاهر وبالطبع من التهاب القولون عن طريق مراقبة لانقاص الوزن التقدمية في المجموعة التي عولجت مفاجآت صيف دبي مقارنة مع مجموعة التحكم. (الشكل 2 مقتبس من 19). بالتنظير، معتدلة إلى حادة القولونيةتيس لوحظ كما يتضح من سماكة جدار القولون، وإجراء التعديلات على نمط الأوعية الدموية (على سبيل المثال، والنزيف من تلقاء أنفسهم، السهم الأحمر)، المتواجدة الفيبرين (السهم الأبيض) وتحبب من سطح الغشاء المخاطي (الشكل 2B). التقييم النسيجي التقليدي للالهيماتوكسيلين ويوزين (سعادة) ملطخة كشفت أقسام القولون ذمة ملحوظة في جدار القولون من المعاملة مفاجآت صيف دبي الآيات الحيوانات السيطرة، وتقع في الغالب في الطبقة تحت المخاطية (الشكل 2 C السهم الرمادي). المقابلة الكمية DHM الصور النقيض من المرحلة وما يتصل بها من خرائط معامل الانكسار التي تم استردادها بواسطة المعادلة 1، يصور أيضا التعديلات الأنسجة المذكورة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، أشار مؤشر الانكسار، مشفرة إلى 256 مستويات الرمادي، والاختلاف في كثافة في طبقات الأنسجة بما في ذلك ظهارة (السهم الأبيض) وسدى (السهم الأسود) في عينات الأنسجة الأم، غير ملوثين (الشكل 2 C). وانخفض مؤشر الانكسار بشكل كبير في الظهارة، وكذلك في الطبقة تحت المخاطية وسدى من الفئران colitic مقارنة مع الاصحاء (الشكل 2 E). بالإضافة إلى ذلك، وجود علاقة ذات دلالة إحصائية بين المعلمة السريرية (فقدان نسبي من وزن الجسم) والمعلمة المادية المطلقة (معامل الانكسار) ويمكن ملاحظة (R 2 = 0.64 الخطية، الشكل 2 D، مقتبس من 19).

تقييم مرض كرون في البشر التي كتبها DHM

كثيرا ما حددت مرض كرون من التغييرات التهابات رائعة من جدار الأمعاء، الكشف عنها بواسطة التنظير الهضمي. تشمل الميزات العيانية مميزة من التفاصيل من سطح الغشاء المخاطي وتقرحات طولية مع exudat الفيبرينأيونات (يشار إليه أيضا باسم "مسارات الحلزون") وعفوية النزيف (الشكل 3). التقييم النسيجي سعادة تلطيخ عينات الأنسجة من المرضى الذين يعانون من CD نشط كثيرا ما تكشف جدار القولون وكذلك وذمة تحت المخاطية. المقابلة الكمية DHM الصور النقيض من المرحلة وما يتصل بها من خرائط معامل الانكسار التي تم استردادها بواسطة المعادلة 1 الكشف أيضا التهابات بوساطة تعزيز / تورم في جدار القولون، وهنا ينظر في ظهارة (الشكل 3 B). وعلاوة على ذلك، فإن معامل الانكسار كمعلمة المطلقة، وأيضا انخفاض كبير في جميع طبقات جدار (ظهارة، تحت المخاطية وسدى) في عينات انسجة القولون من المرضى الذين يعانون من CD نشط آيات تلك في مغفرة (الشكل 3 C).

رصد المتعدد الوسائط من شفاء الجروح في المختبر

جرح كاتشو-2 خلية الشفاء أجريت فحوصات باستخدام طبق بتري خاصا لتوفير ظروف موحدة. تم تجهيز الطبق مع ادخال ثقافة تشكيل مجلسين مختلفة، والتي تكون مفصولة فجوة من 500 ميكرومتر (الشكل 4). لمحاكاة بيئات الفسيولوجية المختلفة، تم فحص الخلايا إما من دون علاج، تحفزها عامل نمو البشرة (EGF) أو مستعمل مع ميتوميسين ج. يسمح الإعداد DHM الرصد المستمر للجرح العملية مع مرور الوقت الشفاء، يصور هنا الكمية DHM الصور النقيض من المرحلة التمثيلية (مشفرة إلى 256 مستويات الرمادي) بعد 0، 22.5 و 45 ساعة بعد بدء التجربة (الشكل 4 ب). المقابلة كاذبة مرمزة المؤامرات الزائفة 3D في الشكل (5) توضيح التنمية المكانية من سمك طبقة الخلايا في ثلاثة دي mensions. واستنادا إلى مسار بصري التأخير طول، معامل الانكسار الخلوي ومعادلات 2 و 3، DHM يسمح التقييم الديناميكي في وقت واحد من الهجرة، وانتشار والتشكل من خلال رصد الزماني من الخصائص الخلوية مثل خلية غطت مساحة السطح، ومتوسط ​​سمك خلية والكتلة الجافة الخلوية ( الرقم 4 C). وباختصار، فإن البيانات في الشكل (4) توضح أن النتائج EGF المحاكاة في الهجرة أسرع من الخلايا في منطقة الجرح، في زيادة متوسط ​​سمك خلية وفي كتلة جافة أعلى في مجال الرؤية مقارنة للسيطرة على الخلايا. في المقابل، ميتوميسين ج تغطي الخلايا تحول دون أي بانخفاض طفيف مساحة من الخلايا السيطرة خلال التجربة وتبين أيضا انخفاض طفيف زيادة الكتلة الجافة. ومع ذلك، فإن متوسط ​​سمك خلية يبدو انخفضت بشكل واضح مقارنة مع كلا، وحفز والخلايا السيطرة.

ن صفحة = "دائما"> شكل 1
الشكل 1. المستغلة الإعداد خارج محور لالرقمي المجسم المجهري (DHM). الإعداد تخطيطي لمحطة DHM (A). المقابلة صورة تصور الإعداد المجهر (راصد، صورة حية وبرامج التحكم (1)، خارج المحور الإعداد المجهر الرقمي (2)، (ب)، مسار بصري المجهر (الخط المنقط الأخضر) وعينة (المشار إليها الأحمر السهم، (C)). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم 2. تقييم يسببها DSS-الفئران التهاب القولون التي كتبها DHM. وقد تبع هذا بالطبع من التهاب القولون التي كتبها يوميا ليasurement من وزن الجسم النسبي والمتكررة بالمنظار فحص المتابعة. ورافق خسارة هائلة من وزن الجسم النسبي من يوم 4 بعد بدء إدارة مفاجآت صيف دبي (مقتبس من 19) (أ) من علامات بالمنظار من التهاب القولون أنشئت بما في ذلك تقرحات التنسيق وضعف الغشاء المخاطي (B). تحليل المقاطع cryostatic التقليدية الملون HE-كشفت وذمة تحت المخاطية، سماكة العضلية وارتشاح التهابي المخاطية وضوحا في الغشاء المخاطي. المقابلة الكمية DHM الصور النقيض من المرحلة وما يتصل بها من خرائط معامل الانكسار التي تم استردادها بواسطة المعادلة 1 (مشفرة إلى 256 مستويات الرمادي) أكد التغييرات ذمي من تحت المخاطية خلال العملية الالتهابية (السهم الأبيض يشير ظهارة، تحت المخاطية الرمادي والأسود سدى) (C). فقدان النسبية من وزن الجسم (معلمة سريرية) مرتبطة بشكل كبير مع معامل الانكسار (معلمة المادية المطلقة، R 2 الخطية = 0.64؛ (D)، مقتبس من 19)، والذي انخفض بشكل كبير في الظهارة وكذلك في الطبقة تحت المخاطية وسدى من الفئران colitic مقارنة مع الاصحاء (يعني ± SEM، *** P <0.001؛ E) الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم فحص الشكل 3. تقييم مرض كرون في البشر التي كتبها DHM. عينات انسجة القولون من المرضى الذين يعانون من مرض كرون أكد بالتنظير وتشريحيا (A). HE-تلطيخ عرض إطالة الخبايا المخاطية وارتشاح ملحوظ من الخلايا الالتهابية. وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن وذمة تحت المخاطية وتوسيع المخصوصة العضلية. تحليل نيوسesponding الكمية DHM الصور النقيض من المرحلة وما يتصل بها من خرائط معامل الانكسار التي تم استردادها بواسطة المعادلة (1) (مشفرة إلى 256 مستويات الرمادي) كشفت أيضا عن التغيرات ذمي (المشار إليها هنا من قبل نجوم الأبيض والأسود) في الظهارة (B). وجود فروقات معنوية في متوسط ​​معامل الانكسار في عينات من المرضى مؤتمر نزع السلاح مع مضيئة النشط (الحانات واضحة) أو غفران (أشرطة سوداء). وينظر إلى هذه الاختلافات في كل نوع من أنواع الأنسجة (يعني ± SEM، *** P <0.001؛ ج). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. رصد طلائي شفاء الجروح التي كتبها الضوء الأبيض المجهر وDHM، وكانت الخلايا المستزرعة تران sferred في أطباق بتري مع تدرج خاصة (السهم الأحمر). قبل إزالة إدراج الثقافة، وعولج الخلايا مع إما EGF أو ميتوميسين ج لمدة 24 ساعة، أو تعامل مع المتوسطة وحدها (مراقبة unstimulated) (A). بعد إزالة إدراج الثقافة، تم رصد التئام الجروح بشكل مستمر من خلال مرحلة التصوير النقيض من DHM مع مرور الوقت. الخطوط العريضة خلية يمكن الاعتراف بشكل واضح. وتظهر الممثلة الكمية DHM الصور النقيض من المرحلة في بداية التجربة، بعد 22.5 ساعة، وفي نهاية القياس بعد 45 ساعة (B). لوحة (C) يدل على تغييرات مماثلة الزمنية في السطح المغطاة الخلية (S ج)، ومتوسط ​​سمك الخلية (د الخلية) والخلوية كتلة جافة (DM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في صفحة = "دائما"> الرقم 5
الشكل (5). التوضيح من طبقة الخلايا الصرف التغييرات التي الكاذبة الزائفة 3 قطع اراضي D مرمزة من التباين صور الكمي DHM المرحلة. التمثيلية كاذبة مرمزة المؤامرات الزائفة 3D من الكمية DHM صور مرحلة التباين في الشكل 4B في تي = 0 بعد 22.5 ساعة و في نهاية القياس بعد 45 ساعة، توضيح التنمية المكانية من سمك طبقات الخلايا للcontrol مع، ميتوميسين والخلايا حفز EGF في 3D-مستعمل ج. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

علينا أن نبرهن على DHM يوفر تقييم دقيق للأضرار النسيجي في نماذج الفئران التهاب القولون وعينات انسجة القولون الإنسان خارج الحي. وعلاوة على ذلك، نحن مبين DHM يمكن رصد مستمر التئام الجروح الظهارية في حين نفس الوقت توفير المعلومات متعددة الوسائط حول التعديلات الخلوية. في DHM، يتم تنفيذ إعادة الإعمار من الصور المجسمة رقميا عدديا 32. ولذلك، بالمقارنة مع المجهر مشرق الميدان، Zernike مرحلة التباين والتفاضلية المجهري تدخل النقيض من ذلك، يوفر DHM النقيض من المرحلة الكمي مع اختياري لاحق تصحيح التركيز العددي (متعدد التركيز التصوير) 27. ويستند الكمي مرحلة التصوير على تحديد التغيرات طول مسار بصري، وبالتالي مستقل للغاية للجهاز قياس المستخدمة. هذا يبسط مقارنة بيانات القياس التي يتم الحصول عليها مع أدوات مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، DHM يتطلب منخفضة فقط شدة الضوء لobjeط م الإضاءة. ويتيح هذا التحليل الغازية الحد الأدنى من الأنسجة تشريح غير ملوثين، ويقلل من كمية عينة التفاعل المطلوب خلال طويلة الأجل الملاحظات الوقت الفاصل بين الخلايا الحية.

وسعت عدة الممارسة العلاجية لمرض التهاب الأمعاء بشكل كبير خلال العقدين الماضيين. إلى جانب إدخال العلاجات TNF ألفا المضادة، والتي يجب تطبيقها في كل من جامعة كاليفورنيا والأقراص المدمجة ويكون مقبولا لمحات من الآثار الجانبية، رواية والأجسام المضادة محددة تستهدف integrins أدخلت مؤخرا في الممارسة السريرية 34-37. ويجري حاليا تقييم العديد من وكلاء واعد آخر لفعالية العلاج في مرض التهاب الأمعاء 38-40. ومع ذلك، قبل الاستخدام السريري في البشر، وفعالية وسلامة هذه العلاجات المحتملة لابد من ثبت في الدراسات الحيوانية. والناجم عن التهاب القولون مفاجآت صيف دبي هو واحد من نماذج التهاب القولون الفئران الأكثر استخداما، ويرجع ذلك إلى استنساخ عالية وتكاليف منخفضة 23. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا النموذج آلذلك أن يطبق على الفئران المعدلة وراثيا سلالات 41. بينما علامات النظامية، على سبيل المثال، CRP، تختلف اختلافا كبيرا في النماذج الحيوانية، وتقييم النسيجي من القولون يمثل الأكثر ملائمة لتقييم شدة المرض 42،43. ومع ذلك، التقييم الكمي للالتهاب النسيجي وفقا لأنظمة التسجيل يعتمد بشكل كبير على خبرة الباحث والخبرة. التقييم الآلي والتهديف عن طريق معايير موضوعية قدر الإمكان مع DHM يتغلب على هذه القيود، وعلاوة على ذلك أيضا توفير الوقت، وتجنب الحاجة إلى تلطيخ 19. وعلاوة على ذلك، DHM يمكن أن تستخدم لفحص عينات القولون الجراحية وكذلك عينات الغشاء المخاطي تم الحصول عليها خلال التنظير.

تجديد الظهارية والتئام الجروح هو آلية محورية خلال عدة عملية المرضية بما في ذلك تقرح المعدة والأمعاء أو تسرب تفاغري. في حين أن هناك واعدة النهج لتقييم التئام الجروح الظهارية في الخامسايفو 44، هذه التقنيات تتطلب أدوات فحص متطورة وغير متوفرة حاليا على نطاق واسع. لذلك، في الوقت الحالي الشفاء الظهارية والتحقيق عادة عن طريق فحوصات الصفر في المختبر 9. هذه المقايسات تسمح الفحص ساري المفعول من إغلاق الجرح ولكن عادة ما يتطلب أولا تلطيخ الخلية، والتي ثم يمنع تكرار التقييم 10،45. وبالإضافة إلى ذلك، لا توجد بيانات تغيير الخلوي يمكن الحصول عليها بالتوازي مع هذا الإعداد التجريبية. ومع ذلك، قد تكون هذه المعلومات ذات أهمية كبيرة لأنها يمكن أن تستخدم للتمييز بين الخلايا وتنخر 46 ولتقييم تكاثر الخلايا والهجرة 46. ولذلك، فإن إمكانية لتحديد سمك خلية والكتلة الجافة أو كثافة الأنسجة في وقت واحد لرصد إغلاق الجرح عن طريق الفحص DHM ذو قيمة عالية في مجال البحوث المخاطية.

وقد أهداف العلاج للمرضى IBD البشري يتغير باستمرار على مدى العقود الماضية <سوب> 47. في حين كان ينظر في البداية السيطرة على التهاب أن تكون ذات أهمية قصوى، في وقت لاحق مغفرة حرة الستيرويد والآن المخاطية الشفاء هي الأهداف الرئيسية للعلاج 48. في الآونة الأخيرة، كان الافتراض بأن مغفرة النسيجية بل قد تكون متفوقة على المخاطية الشفاء وحده 49. ومع ذلك، في حين هناك عدد قليل من أنظمة التهديف النسيجية المتاحة لIBD البشري، لا يزال التباين بين المراقب عالية 50. لذلك، هناك حاجة لاتباع نهج موحد لتقييم عينات القولون النسيجية. DHM يمكن أن تسهم في تحقيق هذا الهدف، وينبغي مواصلة تقييمها في التجارب السريرية المحتملة مع المرضى IBD البشري.

في إجراء التجارب المقدمة، تضاء العينات وتصويرها باستخدام ضوء الليزر متماسك للغاية. ولذلك، فإن قرار في DHM يقتصر أساسا من آثار تشتت وحيود الضوء الناجم عن اختلال إضاءة العينة، وعينات سميكة أو الغبار أوغيرها من الشوائب مثل الماء المكثف في مسار بصري. من أجل الحصول على بيانات قياس دقيقة للغاية من الكمية النقيض من الصور المرحلة DHM، وإعداد دقيق والمواءمة بين الإعداد DHM والعينة هي أهم الخطوات في البروتوكول. تنظيفها عناصر التصوير الضوئي، ولا سيما الهدف مكثف المجهر والمجهر مطلوبة، للحد من الضوضاء. أيضا الشرائح عينة الناقل، طبق بتري الغطاء والقاع، وكذلك الاستفادة مستنبت الخلية يجب أن تكون خالية من الشوائب الجسيمات. ويتحقق ذلك عن طريق تنظيف بعناية جميع المكونات وتصفية كافية من السوائل التطبيقية.

أكثر تفصيلا الخلل النصائح هي على النحو التالي: إذا كان الهولوغرام الرقمي و / أو الكمية DHM الصور المرحلة من أنسجة تشريح صاخبة، قد تكون ملوثة الناقل الزجاج وانزلاق الغطاء مع الغبار. إذا كان الأمر كذلك، تنظيف الناقل الزجاج وانزلاق الغطاء مع الكحول (على سبيل المثال، والإيثانول النقي). إذا كانت سميكةغمرت تشريح الأنسجة كبير جدا (> 10 ميكرون)، وبالتالي يؤدي إلى تشتت الضوء، حاول استخدام أقسام الأنسجة أرق. في الحالة التي تكون فيها الإضاءة مع ضوء الليزر ليست موزعة بشكل متجانس، محاذاة الإضاءة الكائن عبر المكثف المجاهر. إذا مكثف الماء على الجزء السفلي من غطاء زجاجي يؤدي الى آثار نثر، والتحقق من درجة حرارة الغرفة التدفئة والرطوبة غرفة. في حالة كثافة الخلية نمو مرتفعة جدا أو خلية في أكثر من طبقة واحدة، والحد من كثافة الخلايا أثناء إعداد المقايسات شفاء الجروح. وأخيرا، لأنه يقوم DHM على مبدأ التداخل، وطريقة حساسة للاهتزازات أو الاضطرابات الميكانيكية الأخرى، والتي تختلف وفقا للبيئة المختبر الفردية. ومع ذلك، فإن هذه التأثيرات عادة ما يمكن التقليل من التعرض مرات اختياره بشكل كاف (عادة في نطاق ميلي ثانية واحدة أو أقل) لتسجيل السند الخطي خلال إعداد الإعداد التجريبية.

باختصار، تظهر نتائجنا أن DHM يحمل مزايا كبيرة أكثر مشرق الميدان والنقيض من المرحلة تقنيات التصوير المجهري القائمة مثل النقيض المرحلة Zernike ومدينة دبي للإنترنت نظرا لقدرتها على تقييم كمي التهاب النسيجي خارج الجسم بطريقة آلية تقريبا. وعلاوة على ذلك DHM يسمح التقييم المتعدد الوسائط المستمر التسمية خالية من التئام الجروح الظهارية في المختبر مع تفاعل الحد الأدنى مع العينات. هذا يمهد الطريق إلى الفحص النسيجي الآلي من حيث '' علم الأمراض الرقمي '' وإجراء المزيد من الدراسات الموسعة لاستكشاف إمكانات متعدية من DHM على المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء. وبالإضافة إلى ذلك، DHM تقدم رواية في المختبر الفرص لدراسة كميا الهجرة الخلية، مورفولوجيا والانتشار.

ترجمة DHM في الممارسة السريرية لديها القدرة على تحسين التشخيص IBD. كما DHM يسمح الكمي لدرجات مختلفة من التهاب الأمعاء عن طريقالمعلمات المادية مثل التغيرات كثافة، تقييما موضوعيا وأكثر دقة من المرض في الشعور "علم الأمراض الرقمي" يبدو ممكنا. تقييم موضوعي يمكن أن يكون لها تأثير هام على إدارة السريرية للمرضى التهاب الامعاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317 (2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017 (2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210 (2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2 (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009 (2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912 (2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).

Tags

الطب، العدد 115، الجهاز الهضمي، المجهري المجسم الرقمي، الكمي مرحلة التصوير، والتسمية خالية، خالية من البقع، والتهاب، التئام الجروح، المجهر الكمي
المتعدد الوسائط الكمي المرحلة التصوير مع الرقمي المجسم المجهر يقيم بدقة شفاء المعوية والتهاب الجرح طلائي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lenz, P., Brückner, M.,… More

Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter