Abstract
De incidentie van inflammatoire darmziekte, dat wil zeggen, de ziekte van Crohn en Colitis ulcerosa, is sterk toegenomen in het afgelopen decennium. De etiologie van IBD onbekend blijft en Huidige therapeutische strategieën gebaseerd op de niet-specifieke onderdrukking van het immuunsysteem. De ontwikkeling van behandelingen die specifiek darmontsteking en epitheliale wondgenezing zou een belangrijke beheer van IBD, maar dit vereist een nauwkeurige detectie van inflammatoire veranderingen. Momenteel worden potentiële kandidaat-geneesmiddelen meestal geëvalueerd met behulp van diermodellen in vivo of met celkweek gebaseerde technieken in vitro. Histologisch onderzoek vereist meestal de cellen of weefsels van belang te worden gemerkt, dat het monster kenmerken kunnen veranderen en bovendien kan de interpretatie van de resultaten verschillen per onderzoeker deskundigheid. Digitale holografische microscopie (DHM), gebaseerd op de detectie van optische weglengte vertraging maaktvlek-free kwantitatieve fase contrast beeldvorming. Hierdoor kan de resultaten direct worden gecorreleerd met absolute biofysische parameters. We zien hoe het meten van veranderingen in weefseldichtheid met DHM, op basis van brekingsindex meting kan inflammatoire veranderingen kwantificeren zonder kleuring in verschillende lagen van dikke weefselmonsters van muizen en mensen met colitis. Daarnaast tonen we continue multimodaal label-free monitoring van epitheliale wondheling in vitro, mogelijk met behulp van DHM door het eenvoudige geautomatiseerde bepaling van de gewonde gebied en de gelijktijdige bepaling van de morfologische parameters zoals droge massa en laagdikte van migrerende cellen. Concluderend DHM een waardevolle, nieuwe en kwantitatieve hulpmiddel voor de beoordeling van darmontsteking met absolute waarden van parameters mogelijk vereenvoudigd kwantificering van epitheliale wondgenezing in vitro en daarom aanzienlijk kunnen bijdragen translationele diagnostische use.
Introduction
Inflammatoire darmziekte (IBD), dat wil zeggen, colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD) zijn idiopathische inflammatoire aandoeningen van het maagdarmkanaal 1. Onderzoek naar de onderliggende pathofysiologie van IBD en de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen of nieuwe diagnostische benaderingen is bijzonder belangrijk. In zowel fundamenteel onderzoek en de klinische behandeling van IBD patiënten, heeft het darmslijmvlies een aandachtspunt 2,3 geworden. De mucosa vertegenwoordigt een anatomische grens, waarbij de interactie tussen commensale bacteriën, epitheelcellen en diverse cellulaire componenten van het immuunsysteem intestinale homeostase 4,5 orkestreren darm. Echter, in IBD patiënten, ongecontroleerde en hardnekkige darmontsteking leidt tot schade, detecteerbaar als zweren of stenose, die uiteindelijk kan leiden tot afbraak van epitheliale barrièrefunctie, die zelf verergert lokale ontsteking 6 mucosale.
Onlangs digitale holografische microscopie (DHM), een variant van kwantitatieve fase microscopie 14, werd geïdentificeerd als nuttig hulpmiddel voor de beoordeling van epitheliale wondgenezing in vitro en in vivo 15. DHM kan een oordeel weefseldichtheid door het meten van optische weglengte vertraging (OPD) , die de vooruitzichten roman kankerdiagnose 16-18 en kwantificering van ontsteking gerelateerde weefsel veranderingen 19. Daarnaast DHM zorgt voor de opvolging van de morfologie van de cel dynamiek door het bepalen cel dikte, mobiele overdekte oppervlakte en intracellulaire (eiwit) gehalte hoeveelheid
Hier tonen we het gebruik van DHM in een muizenmodel van darmontsteking en ook DHM gelden voor analyse van menselijke weefsels monsters voor kwantitatieve controle van wondgenezing als label-free in vitro assay. Ten eerste, we evalueren inflammatoire veranderingen van verschillende colon muur-lagen in colitic muizen en secties weefsel van mensen met IBD. Na een beschrijving van de DHM kwantitatieve fase imaging procedure, bieden we gedetailleerde instructies voor het gebruik van de microscoop componenten, de voorbereiding van het weefsel secties en beschrijven ook de evaluatie van de verworven kwantitatieve fase beelden.
Vervolgens laten we zien dat DHM uti kan wordenseerd voor continue multimodale monitoring van epitheliale wondheling in vitro, en beschrijven de analyse van cellulaire kenmerken zoals mobiele laagdikte drooggewicht en cellulaire volume geven inzicht in geïnduceerde drug en fysiologische cel veranderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de regionale toetsingscommissie (het Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Duitsland) volgens de Duitse Animal Protection Law. De lokale ethische commissie van de Universiteit van Münster keurde het gebruik van menselijke weefsels voor histologische en microscoop analyse.
1. Dieren en Materialen
- Gebruik vrouwelijke of mannelijke muizen van de vereiste DSS-gevoelige stam die wegen 20 tot 25 g, en het huis volgens de plaatselijke verzorging van dieren wetgeving. Zorg voor speciale chow voor knaagdieren en geautoclaveerd drinkwater ad libitum.
- Induceren acute DSS colitis door toedienen 3% w / v dextran sulfaat natrium (DSS, molecuulgewicht: 36,000-50,000 Da) in geautoclaveerd kraanwater gedurende 5 dagen.
LET OP: De potentie van DSS is zeer variabel, afhankelijk van de fabrikant en batch. Test uw-leverancier verstrekt DSS eerste voor de inductie van de ziekte-activiteit, waarvoor daily lichaamsgewicht is een betrouwbare en objectieve indicator. - Voor histologische evaluatie van colon weefselmonsters, euthanaseren muizen door CO 2 insufflatie (of welke door nationale en institutionele richtlijnen) aan het einde van het experiment.
2. experimentele opstelling voor DSS-colitis en In-vitro Wound Healing Testen
- Celcultuur en oprichting van wondgenezing assay.
- Kweek Caco-2-cellen in een vochtige 95% en 5% CO2 omgeving bij 37 ° C. Gebruik RPMI medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine.
- Zaad Caco-2-cellen bij een dichtheid van 4 x 10 5 cellen / cm2 op 35 mm petrischalen met hoge cultuur-inzetstuk (zie figuur 4A).
LET OP: Het insert genereert twee cel bedekt gebieden die met een bepaalde cel vrije ruimte die de gewonde gebied te analyseren zijn gescheiden. - Verander medium twee dagen na seeding. Uitvoeren door eerst resterende medium met celafval afzuigen met behulp van een automatische pipet, spoelen met 100 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vervangen door vers RPMI medium of medium-serum beroofd.
- Kweekcellen voor 24 uur in serum onthouden medium (0,1% FBS) aangevuld met 20 ng EGF / ml serum of 2 ug mitomycine c / ml serum wordt aangetast wondgenezing activiteiten op te sporen. Voeg normaal RPMI medium met controle cellen gedurende 24 uur.
- Na 24 uur van de cultuur, te verwijderen en gooi cultuur inserts zoals beschreven in stap 3.4 en het uitvoeren van DHM.
- Inductie van acute DSS colitis
- Los 3 g DSS in 100 ml geautoclaveerd water om 3% te krijgen (w / v) oplossing DSS. Zorg voor deze oplossing in plaats van drinkwater aan muizen ad libitum gedurende 7 dagen. Bereken 5 ml van DSS-oplossing per muis / dag. Zorg voor geautoclaveerd water zonder DSS voor controle muizen ad libitum.
- Bereiding van cryostatic delen van muis en humane colon
- Euthanaseren muizen door CO 2 insufflatie aan het einde van het experiment.
- Ontleden de buik van de dieren door laparotomie 23. Verwijder de gehele dikke darm voorzichtig met een pincet en snijd de ileale en rectale end met behulp van chirurgische schaar. Snijd de dikke darm met een schaar lengterichting van de blindedarm naar de rectale uiteinde en open de colon. Verwijderen uitwerpselen uit het monster met een pincet, gevolgd door wassen met PBS 24.
- Bereid Zwitserse rollen door het oprollen van de gehele dikke darm met een katoenen lengterichting knop van de blindedarm naar de rectale einde met het slijmvlies naar binnen gebogen. Insluiten colon monsters optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en blijven ingevroren bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Insluiten menselijke colon weefsel van chirurgische specimen optimale snijtemperatuur oktober verbinding blijven en ingevroren bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Cut secties van 7 urn dikte van de oktober-verbinding ingebedde monsters met de hulp van een cryotome enkel voorafgaand aan het onderzoek.
NB: De optimale dikte van de monsters is afhankelijk van de persistentie en de verstrooiing eigenschappen van het type weefsel dat onderzocht. Voor de beschreven experimenten met colonweefsel, plakdikte> 10 urn veroorzaken aanzienlijke toename van ruis door lichtverstrooiing kwantitatief DHM fasecontrastbeelden, terwijl monsters met een dikte <5 urn hebben een hogere kans op beschadiging geïnduceerde artefacten uit het cryo snijproces. - Transfer secties op een glazen carrier object dia.
3. Technische apparatuur, software en procedures voor acquisitie en evaluatie van Digital Hologrammen
- Digitale holografische microscoop voor kwantitatieve cellen en weefsel imaging
- Gebruik een off-as Mach-Zehnder digitale holografische microscopie voor live cell imaging 25, zie figuur 1. Controleer of de microscoop is uitgerust met een10X microscoop lens, een microscoop podium met een houder voor glazen objectdrager objectglaasjes en petrischalen met een diameter van 35 mm, een droogstoof fysiologische temperatuur op 37 ° C en software voor kwantitatieve fase beeldvorming 25 behouden.
Opmerking: Zoals bijvoorbeeld beschreven in Kemper et al 26 en Langehanenberg et al 27...
OPMERKING: Of gebruik een soortgelijk systeem dat kan uitvoeren helderveld microscopie en kwantitatieve fase beeldvorming van levende cellen en weefsels dia ontleed is. - Schoon microscooplens en koeler met lensreinigingspapier en een reinigingsmiddel (bijvoorbeeld ethanol) zoals aanbevolen door de fabrikant van de microscoop stof of andere verontreinigingen te verwijderen.
- Start het beeld acquisitie software van de DHM microscoop, selecteer "bright field" imaging-modus en switch "op" wit licht verlichting. Zorgen voor Köhler-verlichtinatie van het monster zoals aanbevolen door de fabrikant microscoop met inachtneming van het monster in de live-imaging venster van het beeld acquisitie software (als alternatief een standaard afbeelding acquisitie software kan worden gebruikt in deze stap).
OPMERKING: De beeldintensiteit moet homogeen verdeeld in het gezichtsveld en de monsterpositie mag niet bewegen bij optische heroriëntatie met de focus aandrijving van de microscoop. - Selecteer "DHM" imaging-modus, zet "off" wit licht verlichting en schakelaar "aan" het laserlicht. Controleer of de belichting met laserlicht homogeen is (dat wil zeggen, dat de lichtintensiteit homogeen verdeeld in de live-imaging raam van de imaging-acquisitie software van de DHM microscoop) en constateren dat de off-as carrier interferentierand patroon lijkt met voldoende contrast in de vastgelegde beelden (digitale hologrammen).
- Gebruik een off-as Mach-Zehnder digitale holografische microscopie voor live cell imaging 25, zie figuur 1. Controleer of de microscoop is uitgerust met een10X microscoop lens, een microscoop podium met een houder voor glazen objectdrager objectglaasjes en petrischalen met een diameter van 35 mm, een droogstoof fysiologische temperatuur op 37 ° C en software voor kwantitatieve fase beeldvorming 25 behouden.
- Bereiding van cryostaat secties voor beeldvormingmet DHM
- Neem het monster (cryostaatsectie op een glazen objectdrager en een dikte van 7 urn, zoals beschreven in 2.3) uit de vriezer. Ontdooi het monster gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur en normale atmosfeer.
- Voeg 50-100 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor de inbedding op de weefselsectie met een pipet totdat deze volledig bedekt met buffer. Bedek het monster met een schone glazen afdekplaat slip (glasdikte 170 pm).
OPMERKING: Over-drogen kan sterk veranderen de brekingsindex en verstrooiing eigenschappen van het monster te induceren. - Controleer of de bodem van de glazen drager en het dekglaasje worden gereinigd van stof en andere verontreinigingen die lichtverstrooiing kan veroorzaken. Het monster is klaar voor onderzoek met heldere veld microscopie en DHM.
- Kwantitatieve fase beeldvorming van weefsel secties met DHM
- Schakel de digitale holografische microscoop, kies de 10X microscoop lens voor de beeldvorming. Start de image acquisitie software van de DHM microscoop en selecteer heldere bestand imaging-modus.
- Plaats het weefsel dia zoals beschreven in 2) in de microscoop diahouder, met het deksel slip tegenover de microscoop doelstelling.
- Switch "op" de heldere veld verlichting van de DHM microscoop. Plaats het monster met de microscoop podium en ervoor te zorgen dat het weefsel gebied van belang is zichtbaar in het live bewaking venster. Het verbeteren van de scherpte van het beeld met behulp van de microscoop focus rijden.
OPMERKING: Naast het interessegebied, dient een gebied van dia zonder weefsel ook in het gezichtsveld worden. - Leg een heldere veld afbeelding van de scherp monster met behulp van het beeld acquisitie software.
- Selecteer "DHM" imaging-modus, zet "off" het witte licht verlichting en "aan" het laserlicht verlichting. Selecteer de "exposure time" voor hologram opname onder de 3 msec, constateren dat holographic off-axis interferentie franjes verschijnen met voldoende contrast in de live-imaging raam van de imaging-acquisitie software en het veroveren van een digitaal hologram.
- Herhaal stap 3.3.3 - 3.3.5 totdat er een voldoende aantal heldere veld beelden en digitale hologrammen van verschillende sample gebieden zijn opgenomen. Hologram overname is nu voltooid.
- Bereiding van wondheling assays voor DHM beeldvorming
- Schakel de petrischaal verwarmingskamer van de DHM microscoop ongeveer 1-3 uur voor aanvang van het experiment te waarborgen stabiele temperatuur tijdens de metingen DHM.
- Bereid werkbank met de gewenste uitrusting (petrischaal voor wondgenezing assay wordt beschreven in 2.3): pipetten, pincet, glazen deksel petrischaal, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) gebufferde celkweekmedium met fysiologische temperatuur (37 ° C) gedurende voorbehandeling steriele omgeving.
LET OP: NaHCO3. - Verwijder het plastic deksel van de petrischaal en verwijder het celkweekmedium met een pipet. Verwijder het inzetstuk uit de petrischaal bodem met een pincet.
- Was het monster 1-2 maal met 1 ml HEPES gebufferd celkweekmedium om dode cellen en de resterende cellulaire componenten (bijvoorbeeld serum) in de wond gebied te verwijderen. Voeg 2 ml HEPES gebufferd celkweekmedium en dop de petrischaal met de glazen deksel.
- Controleer of de glazen deksel en de bodem petrischaal werden ontdaan van stof en andere verontreinigingen. Monster is klaar voor time lapse observatie met DHM.
- Continue multimodale controle van de wondgenezing in vitro met DHM
- Schakel de petrischaal verwarmingskamer van de DHM microscoop ongeveer 1-3 uur voorafgaandde start van het experiment te waarborgen stabiele temperatuur tijdens de metingen DHM.
- Switch "op" de digitale holografische microscoop, selecteer de 10X microscoop lens voor de beeldvorming. Start het beeld acquisitie software van de DHM microscoop en selecteer "helder gebied" imaging-modus. Controleer of de verwarmingskamer voor de petrischaal werkt een fysiologische temperatuur (37 ° C).
- Plaats de petrischaal met wondgenezing assay, bereid zoals in 4) in de verwarmingskamer van de DHM microscoop.
- Selecteer helderveld imaging-modus en de positie van het monster met de microscoop podium, terwijl het waarnemen in de live bewaking raam van het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. Merk op dat het gewenste gebied van het monster scherp scherp is onder wit licht verlichting.
- Leg heldere veld beelden van verschillende delen van het monster (wond en de omliggende gebieden met samenvloeiende cellen) onder witlicht verlichting met het beeld acquisitie software en documenten uiterlijk, celdichtheid en homogeniteit.
- Selecteer "bright field" imaging-modus van de DHM microscoop. Kies een geschikte wond gebied onder wit licht verlichting in de live bewaking venster met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop. Zorg ervoor dat de wond gebied is vrij van dode cellen en geen serum overblijfselen, en ervoor te zorgen dat beide zijden zijn voorzien van een enkele homogene cellaag, bij voorkeur met rechte randen.
- Het veroveren van een wit licht beeld van de oorspronkelijke wond gebied in heldere field imaging-modus met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop.
- Turn "off" wit licht verlichting, selecteer "DHM" mode en switch "op" laser verlichting. Selecteer een belichtingstijd van 3 hieronder msec hologramopname (constateren dat holografische as af interferentiebanden verschijnen voldoende contrast in het levende beeldvorming raam van de beeldacquisitie software tHij DHM microscoop) en het veroveren van een digitaal hologram.
- Leg een monster hologram in DHM-modus met het beeld acquisitie software en reconstrueren van een beeld kwantitatieve fase met de reconstructie software van de DHM microscoop om de beeldkwaliteit te controleren.
- Kies een geschikte tijdvertraging (bv 3-5 min) voor time-lapse hologram overname met het beeld acquisitie software van de DHM microscoop.
- Selecteer de time-lapse overname modus van de afbeelding acquisitie software waarin het monster alleen met laserlicht wordt verlicht tijdens het hologram acquisitie.
- Start de time-lapse DHM observatie van de wondgenezing assay.
- Stop de time-lapse acquisitie na de beoogde tijd in, selecteer helderveld imaging-modus en documenteren van de uiteindelijke verschijning van het monster onder wit licht imaging.
- Reconstrueren digitale hologrammen van ontleed weefsel en bepaal de gemiddelde brekingsindex als parameter te kwantificerenweefsel dichtheid
- Reconstrueren kwantitatieve fase beelden van digitale hologrammen van ontleed weefsel met de software van de DHM microscoop, bijvoorbeeld zoals beschreven in Kemper et al. 26 en Langehanenberg et al. 27.
- Bepaal de gemiddelde fase contrast Δφ in verschillende weefsel lagen (epitheel, submucosa, stroma) in geschikt gekozen regio's van belang (ROI) 19.
- Bepaal de brekingsindex van het inbeddingmedium door een refractometer of als alternatief met behulp van een juiste waarde in de literatuur. (brekingsindex waarden voor typische inbedding media: n water = 1,334 28, n fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) = 1,337 29, n celkweekmedium = 1,337-1,339 29,30).
- Bereken de brekingsindex van verschillende weefsel lagen van de gemiddelde fase contrast waarden 19
NB: In Eq. 1 λ de golflengte van het laserlicht (hier: λ = 532 nm), d de dikte van de ontleed weefsel (hier: 7 urn) en n medium is de brekingsindex van het inbeddingsmedium (hier: n medium = n PBS = 1,337, bepaald door een Abbe-refractometer).
- Reconstrueren en digitale hologrammen evalueren van de time-lapse wondgenezing serie observatie
- Reconstrueren kwantitatieve fase beelden van de time lapse hologram serie verkregen tijdens wondgenezing observatie met de microscoop DHM software 26,27.
- Normaliseren elke reeks kwantitatieve fase beelden naar de afbeelding met een maximale fase contrast.
- Bepaal het oppervlak Sc dat wordt gedekt door de cellen in de kwantitatieve DHM fasebeelden door beeldsegmentatie Dit kunnen pergevormd met behulp van de gratis software cel profiler (www.cellprofiler.org 31).
- Bereken de gemiddelde fasecontrast van de cellen Δφ cel in het gebied Sc.
- Haal de cellulaire drooggewicht DM uit de gemiddelde fase contrast Δφ cel in het gebied S c 15
(2)
Opmerking: In Vergelijking 2 DM geeft de cellulaire drooggewicht, Sc presenteert het gebied dat wordt ingenomen door de cellen en α = 0,002 m 2 / kg. - Bepaal de integrale cellulaire brekingsindex n cel en de brekingsindex van het celkweekmedium n medium. Bepaal n cel afzonderlijk experimenteel van gesuspendeerde cellen, zoals beschreven in 30 en meet n medium met een refractometer. Alternatief gebruiken literatuur waarden voor n cel 30 en n gemiddeld 29,30.
- Bereken de gemiddelde cel dikte d cel λ, Δφ cel, n cel en n gemiddeld 26,32
(3)
NB: In Eq. 3 de parameter d cel de gemiddelde celdikte, λ duidt de licht golflengte van het laserlicht, Δφ cel staat voor de gemiddelde fasecontrast en n cel en n medium zijn de integrale cellulaire brekingsindex en de brekingsindex van het omringende medium.
(2) 
(3) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typische Setup voor DHM Imaging voor Digitale Holografische Microscopie (DHM)
Om helderveld imaging en kwantitatief fasecontrast DHM uitvoeren, pasten we een omgekeerde microscoop zoals in figuur 1 B. Het systeem werd gemodificeerd door het aanbrengen van een DHM module, zoals eerder 25 beschreven. Digitale hologrammen werden gegenereerd door belichting van het monster met licht van een in frequentie verdubbelde Nd: YAG laser λ = 532 nm) in Mach-Zehnder configuratie (Figuur 1 A). Ontleed weefsels werden ex vivo geanalyseerd op glas carrier dia's. Levende celkweken werden waargenomen in speciale Petrischalen voor het waarnemen wondgenezing zoals getoond in fig. 1 C. De monsters werden afgebeeld in transmissieverlichting via een 10X microscope lens (NA = 0,3) en een tube lens. Een ladingsgekoppelde inrichting camera werd gebruikt om de interferentiepatronen (digitale hologrammen off-as) gegenereerd door superpositie van het beeldbestand (objectgolf) met de licht gekantelde referentiegolf opnemen. De digitaal vastgelegde hologrammen werden gereconstrueerd door de ruimtelijke faseverschuiving wederopbouw in combinatie met de optionele holografische autofocus 26,33.
Beoordeling van de muizen DSS-geïnduceerde colitis door DHM
Acute colitis werd geïnduceerd in muizen door toediening van 3% w / v dextran natrium sulfaat (DSS) in drinkwater gedurende 5 dagen. De manifestatie en het verloop van colitis werd gevolgd door het volgen van progressief gewichtsverlies in de met DSS behandelde groep vergeleken met de controlegroep. (Figuur 2 A aangepast van 19). Endoscopisch, matige tot ernstige colitis werd waargenomen zoals weergegeven door verdikking van de dikke wand, veranderingen van de vasculaire patroon (bijvoorbeeld spontane bloeden, rode pijl), fibrine exudations (witte pijl) en granulariteit van het slijmvliesoppervlak (figuur 2B). Conventionele histologische evaluatie van hematoxyline en eosine (HE) gekleurd dikke gedeelten geopenbaard duidelijke oedeem in de dikke wand van DSS-behandelde controledieren vers, hoofdzakelijk in de submucosa (figuur 2 C grijze pijl). DHM overeenkomstige kwantitatieve fasecontrast beelden en verwante brekingsindex kaarten opgehaald door Vergelijking 1, ook afgebeeld bovengenoemde weefselveranderingen. Bovendien, de brekingsindex, gecodeerd 256 grijsniveaus aangegeven dichtheidsverschillen in weefsellagen onder het epitheel (witte pijl) en stroma (zwarte pijl) in natieve, ongekleurd weefselmonsters (Figuur 2 C). De brekingsindex was significant verminderd in het epitheel alsook in de submucosa en stroma van de colitic muizen vergeleken met de gezonde controles (figuur 2E). Bovendien kan een significante correlatie tussen de klinische parameter (relatief verlies van lichaamsgewicht) en de absolute fysische parameter (brekingsindex) worden waargenomen (R2 lineaire = 0,64; figuur 2 D, aangepast van 19).
Beoordeling van de ziekte van Crohn bij mensen door DHM
ziekte van Crohn wordt vaak aangegeven opmerkelijke inflammatoire veranderingen van de darmwand, gedetecteerd door gastrointestinale endoscopie. Karakteristieke macroscopische eigenschappen bestaan uit granulariteit van het mucosale oppervlak, longitudinale zweren met fibrine exudationen (ook aangeduid als "slak paden") en spontane bloeding (figuur 3A). Histologische evaluatie door HE kleuring van weefselmonsters van patiënten met actieve CD blijkt vaak dikke wand en submucosaal oedeem. DHM overeenkomstige kwantitatieve fasecontrast beelden en verwante brekingsindex kaarten opgehaald door Vergelijking 1 gedetecteerd inflammatoir gemedieerde versterking / zwelling van de dikke wand, hier te zien in het epitheel (figuur 3 B). Voorts is de brekingsindex als absolute parameter, was ook significant verminderd bij alle lagen wand (epitheel, submucosa en stroma) in colon weefselmonsters van patiënten met actieve CD teksten die in remissie (figuur 3 C).
Multimodaal Monitoring van wondgenezing In-vitro
Caco-2 cellen met wondgenezing werden uitgevoerd met een speciale petrischaal gestandaardiseerde omstandigheden. De schotel is voorzien van een kweekinsertie die twee verschillende kamers, die zijn gescheiden door een tussenruimte van 500 pm (Figuur 4 A). Verschillende fysiologische omgevingen te simuleren, werden de cellen onderzocht of zonder behandeling, gestimuleerd door epidermale groeifactor (EGF) of geremd met mitomycine c. De DHM opstelling laat continue bewaking van het wondgenezingsproces tijd, hier afgebeeld door representatieve DHM kwantitatief fasecontrast beelden (gecodeerd tot 256 grijsniveaus) na 0, 22,5 en 45 uur na de start van het experiment (Figuur 4 B). Overeenkomstige false kleurgecodeerde pseudo 3D plots in figuur 5 illustreren de ruimtelijke inrichting van cellaag dikte in drie diqua afmetingen. Gebaseerd op de optische weglengte vertraging de cellulaire brekingsindex en vergelijkingen 2 en 3, DHM maakt gelijktijdige dynamische opvolging van migratie, proliferatie en morfologie van temporele controle van cellulaire eigenschappen zoals mobiele bestreken oppervlak, gemiddeld celdikte en cellulaire drooggewicht ( figuur 4 C). Samenvattend, de gegevens in figuur 4 illustreren dat EGF simulatieresultaten in een snellere migratie van cellen in het wondgebied, in een grotere gemiddelde celgrootte dikte en in een hogere drooggewicht in het gezichtsveld vergeleken met controle cellen. Daarentegen mitomycine c geremde cellen omvatten iets kleinere oppervlakte dan controlecellen gedurende het verloop van het experiment en tonen ook een iets lagere massatoename droog. Echter lijkt de gemiddelde celdikte duidelijk gedaald ten opzichte van zowel gestimuleerde en controlecellen.
Figuur 1. Gebruikt Off-as instelling voor digitale holografische microscopie (DHM). Schematische opstelling van de DHM werkstation (A). Overeenkomstige foto die van de microscoop setup (monitor, live-beeld en controle software (1), off-axis setup digitale microscoop (2), (B), het optische pad van de microscoop (groene stippellijn) en een monster (aangegeven door rood arrow, (C)). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Beoordeling van de muizen DSS-geïnduceerde colitis door DHM. Het verloop van colitis werd gevolgd door de dagelijkse measurement van relatieve lichaamsgewicht en herhaalde endoscopische follow-up onderzoek. Een enorme aantal relatieve lichaamsgewicht vanaf dag 4 na het begin van DSS toediening (naar 19) (A) werd gepaard met endoscopische symptomen van colitis vastgesteld waaronder focale ulceraties en mucosale kwetsbaarheid (B). Analyse van conventionele HE-gekleurde cryostatic secties onthuld submucosale oedeem, verdikking van de muscularis en een uitgesproken mucosale inflammatoire infiltreren in het slijmvlies. DHM overeenkomstige kwantitatieve fasecontrast beelden en verwante brekingsindex kaarten opgehaald door Vergelijking 1 (gecodeerd tot 256 grijsniveaus) bevestigde de oedemateus veranderingen van de submucosa bij het ontstekingsproces (witte pijl geeft epitheel, grijs en zwart submucosa stroma) (C). Het relatieve verlies aan lichaamsgewicht (klinische parameter) significant gecorreleerd met de brekingsindex (absolute fysische parameter, R 2 lineaire = 0,64; (D), aangepast van 19), die aanzienlijk in het epitheel en in de submucosa en stroma van de colitic muizen vergeleken met de gezonde controles werd verlaagd (gemiddelde ± SEM, *** P <0,001;. E) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Beoordeling van de ziekte van Crohn bij mensen door DHM. Colon weefselmonsters van patiënten met endoscopisch en histologisch bevestigde ziekte van Crohn werden onderzocht (A). HE-kleuring weergegeven verlenging van mucosale crypten en een duidelijke infiltratie van ontstekingscellen. Verder submucosale oedeem en uitbreiding van de muscularis propria gedetecteerd. Analyse van corrEN ANTWOORD DHM kwantitatief fasecontrast beelden en verwante brekingsindex kaarten opgehaald door Vergelijking (1) (gecodeerd 256 grijsniveaus) bleek ook oedemateus veranderingen (hier aangegeven met witte en zwarte ster) in het epitheel (B). Significante verschillen in de gemiddelde brekingsindex werden gedetecteerd in monsters van CD patiënten met actieve flare (duidelijke balken) of remissie (zwarte balken). Deze verschillen zijn te zien in elk type weefsel (gemiddelde ± SEM, *** p <0,001; C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Monitoring van epitheliale wondheling door White Light Microscopie en DHM. Gekweekte cellen waren transferred in Petri gerechten met speciale inserts (rode pijl). Vóór cultuur inserts werden verwijderd, werden cellen behandeld met hetzij EGF of mitomycine C gedurende 24 uur, of behandeld met alleen medium (niet gestimuleerde controle) (A). Na verwijdering van de cultuur inserts, werd wondgenezing continu bewaakt door fase contrast beeldvorming door DHM in de tijd. Cell contouren kon duidelijk worden herkend. Representatieve DHM kwantitatief fasecontrast beelden worden getoond aan het begin van het experiment, na 22,5 uur en aan het einde van de meting na 45 uur (B). Paneel (C) toont de overeenkomstige tijdelijke veranderingen in de cel bedekte oppervlak (S c), de gemiddelde cel dikte (d cel) en de cellulaire drooggewicht (DM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Illustratie van cellaag morfologie Changes van False Kleurgecodeerde Pseudo 3 D Plots van de Quantitative DHM Fase contrastrijke beelden. Vertegenwoordiger valse kleurgecodeerde pseudo 3D-grafieken van de kwantitatieve DHM fasecontrast beelden in figuur 4B op t = 0, na 22,5 uur en aan het einde van de meting na 45 uur, illustreren de ruimtelijke ontwikkeling van de dikte van de cel lagen voor control-, mitomycine-c remde en-EGF gestimuleerde cellen in 3D. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We laten zien dat DHM zorgt voor een nauwkeurige evaluatie van de histologische schade in muizen colitis modellen en colon weefselmonsters menselijk ex vivo. Verder hebben we aangetoond DHM kan continu monitoren epitheliale wondgenezing en tegelijkertijd multimodale informatie over cellulaire veranderingen. In DHM, is de reconstructie van digitaal vastgelegde hologrammen numeriek 32 uitgevoerd. Daarom is in vergelijking met helderveld microscopie, Zernike fase contrast en differentieel interferentie contrast microscopie, DHM bepaalt kwantitatief fasecontrast met eventuele volgende numerieke scherpstelling (multi-focus imaging) 27. Kwantitatieve fase beeldvorming is gebaseerd op de bepaling van de optische padlengte verandering en dus sterk afhankelijk van de meetinrichting gebruikt. Dit vereenvoudigt de vergelijking van meetgegevens die zijn verkregen met verschillende instrumenten. Daarnaast DHM vereist slechts lage lichtintensiteit voor object verlichting. Dit maakt een minimaal invasieve analyse van ongekleurde ontleed weefsels en minimaliseert de hoeveelheid monster interactie vereist bij langdurige time-lapse observaties van levende cellen.
Het therapeutisch arsenaal voor IBD is aanzienlijk uitgebreid in de afgelopen twee decennia. Naast de invoering van anti- TNF-α therapieën, die effectief zijn in zowel UC en CD zijn en acceptabele bijwerkingsprofielen, nieuwe en specifieke antilichamen gericht integrinen werden onlangs in de klinische praktijk 34-37. Verschillende andere veelbelovende middelen worden momenteel geëvalueerd voor hun therapeutische werkzaamheid bij IBD 38-40. Voorafgaand aan het klinisch gebruik bij mensen, de werkzaamheid en veiligheid van deze potentiële therapieën moet worden aangetoond in dierproeven. De DSS-geïnduceerde colitis is een van de meest gebruikte colitis muis modellen, vanwege de hoge reproduceerbaarheid en lage 23. Daarnaast heeft dit model kan alzodanig worden toegepast genetisch gemanipuleerde muizen stammen 41. Terwijl systemische markers, bijvoorbeeld, CRP, zijn zeer variabel in diermodellen, histologische beoordeling van de dikke darm is de meest geldige benadering ziektestrengheid 42,43 beoordelen. Niettemin kwantitatieve evaluatie van histologische ontsteking volgens scoringssystemen sterk afhankelijk onderzoeker kennis en ervaring. Geautomatiseerde evaluatie en scoren door objectieve parameters mogelijk met DHM overwint deze beperkingen, en bovendien is het ook tijd te besparen, het vermijden van de noodzaak voor het kleuren van 19. Verder kan DHM worden gebruikt om chirurgische specimens colon en slijmvlies monsters verkregen tijdens endoscopische onderzoeken.
Epitheliale regeneratie en wondgenezing is een cruciaal mechanisme gedurende meerdere pathologisch proces waaronder gastro-intestinale ulcera of naadlekkage. Hoewel er zijn veelbelovende benaderingen van epitheliale wondheling in v beoordelenivo 44 Deze technieken vereisen geavanceerde onderzoek instrumenten en zijn nog niet overal verkrijgbaar. Daarom momenteel epitheliale genezing wordt gewoonlijk onderzocht door scratch assays in vitro 9. Deze testen laten geldig onderzoek van wondsluiting maar meestal eerst moet de cel kleuring, die vervolgens voorkomt herhaald evaluatie 10,45. Bovendien kan geen cellulaire verandering gegevens verkregen parallel aan deze experimentele opstelling. Echter, deze informatie van groot belang omdat het kan worden gebruikt om tussen apoptose en necrose 46 en proliferatie en migratie van 46 cellen te beoordelen. Daarom moet de mogelijkheid om mobiele dikte drooggewicht of weefsel dichtheid gelijktijdig aan de controle van de wondsluiting door DHM onderzoek te bepalen is van grote waarde in mucosale onderzoek.
Behandeldoelen voor menselijke IBD patiënten zijn voortdurend in beweging de laatste decennia <sup> 47. Hoewel in eerste instantie de controle van de ontsteking werd gezien van primair belang, later steroïde-free remissie te zijn en nu mucosale genezing zijn de primaire doelen van de behandeling 48. Recent werd verondersteld dat histologische remissie zelfs beter genezing alleen 49 mucosale zijn. Echter, terwijl er een paar histologische scoring-systemen beschikbaar zijn voor de menselijke IBD, de inter-observer variabiliteit blijft hoog 50. Daarom is er behoefte aan een gestandaardiseerde procedure voor de beoordeling van histologische monsters colon. DHM kan bijdragen aan deze doelstelling en moet verder worden geëvalueerd in een prospectieve klinische studie met menselijke IBD patiënten.
In de experimentele procedure gepresenteerd worden de monsters belicht en afgebeeld met behulp van zeer coherent laserlicht. Derhalve wordt de resolutie DHM voornamelijk beperkt door lichtverstrooiing en diffractie effecten door onjuiste uitlijning van het monster verlichting, dikke monsters, stof ofandere verontreinigingen zoals gecondenseerde water in de optische baan. Met het oog op zeer nauwkeurige meetgegevens te bereiken van kwantitatief DHM fasecontrast beelden, zorgvuldige voorbereiding en afstemming van de DHM setup en het monster zijn de belangrijkste stappen in het protocol. Grondig gereinigd optische beeldvormende elementen, met name de microscoop condensor en microscoopobjectief, moeten ruis te minimaliseren. Ook monsterdrager slides petrischaal deksel en bodem, alsmede de gebruikte celkweekmedium moet vrij van deeltjesvormige verontreinigingen. Dit wordt bereikt door zorgvuldige reiniging van alle onderdelen en adequate filtering van de toegepaste vloeistoffen.
Meer gedetailleerde oplossen van problemen tips zijn als volgt: als de digitale hologram en / of de kwantitatieve DHM fase beelden van ontleed weefsels zijn lawaaierig, kan de glazen drager en dekglas worden vervuild met stof. Als dat zo is, het reinigen van de glazen drager en dekglas met alcohol (bv, pure ethanol). Als de dikkeheid van ontleed weefsel is te groot (> 10 pm) en dus resultaten in lichtverstrooiing, proberen met behulp van dunnere weefselcoupes. Indien de belichting met laserlicht niet homogeen verdeeld Zet de objectverlichting via de condensor microscopen. Als gecondenseerd water op de bodem van de glazen deksel induceert verstrooiing effecten, controleer dan de temperatuur van de verwarming kamer en luchtvochtigheid. Indien de celdichtheid te hoog of celgroei in meer dan één laag, verminderen de celdichtheid tijdens de bereiding van wondheling assays. Ten slotte DHM is gebaseerd op het principe van interferometrie, de werkwijze is gevoelig voor trillingen of andere mechanische storingen, die afhankelijk van de individuele laboratoriumomgeving. Dergelijke invloeden meestal kan worden geminimaliseerd door een passende opstelling belichtingstijden (typisch in milliseconden of minder) voor holografie opname tijdens de bereiding van de experimentele opstelling.
samengevatOnze resultaten tonen aan dat DHM heeft belangrijke voordelen boven bestaande helderveld en fasecontrast microscopie technieken zoals Zernike fasecontrast en DIC vanwege zijn vermogen een kwantitatieve beoordeling histologische ontsteking ex vivo in bijna geautomatiseerd. Verder DHM laat label-free continue multimodale evaluatie van epitheliale wondheling in vitro met minimale interactie met de monsters. Dit effent de weg naar geautomatiseerde histologisch onderzoek in termen van '' digitale pathologie '' en verder uitgebreid onderzoek naar de translationele potentieel van DHM bij patiënten met IBD verkennen. Daarnaast DHM biedt nieuwe mogelijkheden in vitro kwantitatief bestuderen celmigratie, morfologie en proliferatie.
De vertaling van DHM in de klinische praktijk heeft de potentie om IBD diagnose verbeteren. Zoals DHM maakt de kwantificering van verschillende graden van darmontsteking viafysische parameters zoals dichtheidsveranderingen, een objectieve en nauwkeurige beoordeling van de ziekte in de zin van een "digitale pathologie" mogelijk lijkt. De objectieve beoordeling kan een belangrijke impact op de klinische behandeling van IBD patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Azoxymethane (AOM) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 | |
| Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| DMEM/Ham's F12 | PAA Laboratories - Pasching - Austria | E15-813 | |
| EGF | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| Mitomycin C | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 | |
| Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 | |
| DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 | |
| Equipment | |||
| MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 | |
| Digital holographic microscope | |||
| Component | Model | Company | |
| Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany | |
| Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany | |
| Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany | |
| CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
- Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
- Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
- Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
- Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
- Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
- Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
- Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317 (2014).
- Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
- Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017 (2011).
- Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210 (2015).
- Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
- Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
- Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
- Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
- Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B.
- Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
- Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
- Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
- Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
- Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
- Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
- Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
- Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912 (2012).
- Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
- Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
- Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
- Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).
