Abstract
炎症性腸疾患の発生率、 すなわち、クローン病および潰瘍性大腸炎は、大幅に過去10年間で増加しています。 IBDの病因は不明のままであり、現在の治療戦略は、免疫系の非特異的抑制に基づいています。具体的に有意にIBDの管理を改善することができ、腸の炎症および上皮創傷治癒を標的とする治療法の開発は、しかし、これは、炎症性の変化を正確に検出する必要があります。現在、潜在的な薬物候補は、通常、 インビボまたはインビトロでの細胞培養に基づく技術を用いて、動物モデルを用いて評価されます。組織学的検査は、通常、サンプルの特性を変えることができ、さらに、調査結果の解釈は研究者の専門知識によって変えることができ、目的の細胞または組織染色することが必要です。デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）は、光路長遅延の検出に基づいて、可能汚れのない定量的位相コントラストイメージング。この結果は、直接絶対生物物理学的パラメータと相関させることを可能にします。私たちは、屈折率測定に基づいて、DHMと組織密度の変化の測定は、大腸炎マウスとヒトの結腸組織標本の異なる層に、染色することなく、炎症性の変化を定量化する方法を示しています。さらに、当社は、創傷領域の簡単な自動化された決意と、そのような移行細胞の乾燥質量と層の厚さなどの形態学的パラメータの同時決意を通じてDHMを使用して可能in vitroでの上皮創傷治癒、の連続マルチモーダルラベルフリーの監視を実証します。結論として、DHMは貴重な、新規かつ定量的なツールの可能なパラメータの絶対値を持つ腸の炎症を評価するための、in vitroでの上皮創傷治癒の簡素化定量化を表し、したがって、翻訳診断uのための高い可能性を秘めていますSE。
Introduction
炎症性腸疾患（IBD）、 すなわち、潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、消化管1の特発性炎症性障害です。 IBDの根底にある病態生理および潜在的な新薬や新たな診断手法の評価の研究は、特に重要です。基礎研究およびIBD患者の臨床管理の両方で、腸粘膜が注目2,3の焦点となっています。粘膜は、共生細菌、上皮細胞および腸の免疫系の種々の細胞成分間の相互作用は、腸のホメオスタシス4,5を編成れる解剖学的境界を表します。しかし、IBD患者に、制御されていないと持続性の腸の炎症は最終的にそれ自体が局所の炎症6を悪化させる上皮バリア機能の崩壊に終わることができます潰瘍や狭窄などの検出可能な損傷を、粘膜につながります。
最近、デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）、定量的位相顕微鏡14の変異体は、 インビトロおよびインビボ 15 における上皮の創傷治癒の評価のための有用なツールとして同定された。DHMは、（OPD）の光路長遅延を測定することにより、組織密度の評価を可能にします、その見通し新たな癌の診断16-18と炎症関連組織の変化19の定量化。また、DHMは、セルの厚さ、セル覆われた表面領域および細胞内（タンパク質）コンテンツ量を決定することにより、細胞形態動態のモニタリングを可能にします
ここでは、腸の炎症のマウスモデルにおけるDHMの使用を実証し、また、ラベルフリーのin vitroアッセイとして、創傷治癒の定量的モニタリングのためのヒト組織試料の分析にDHMを適用します。まず、我々は、IBDを有するヒトから大腸炎マウスおよび組織切片における異なる結腸壁層の炎症性変化を評価します。 DHM定量位相画像化手順を説明した後、我々は、詳細な顕微鏡部品を使用するための指示、組織切片を調製し、また、取得した定量的な位相画像の評価を記述を提供します。
次に、我々は、DHMはUTIできることを示していますin vitroでの上皮創傷治癒の連続マルチモーダル監視のためlized、および細胞層の厚さ、乾燥質量と細胞容積のような細胞の特性の分析を記述し、薬物誘導し、生理的な細胞の変化への洞察を与えます。
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Protocol
全ての動物実験は、ドイツ動物保護法に基づく（Landesamtエリーゼナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、LANUV、ドイツ）地域の倫理委員会によって承認されました。ミュンスター大学の地元の倫理委員会は、組織学的および顕微鏡分析のためのヒト組織の使用を承認しました。
1.動物と材料
- 地元の動物管理法律に従って女性または20〜25グラムの重量を量る必要DSS-感受性株の雄マウス、および家を使用してください。げっ歯類のための特別な餌を与え、水を自由に飲んでオートクレーブ処理。
- 5日間オートクレーブ水道水で：W / Vデキストラン硫酸ナトリウム（36,000-50,000ダDSS、分子量）の3％を投与することによって急性 DSS大腸炎を誘発します。
注：DSSの効力はメーカーやバッチに応じて非常に可変です。これはダのために、疾患活性の誘導のための最初のサプライヤが提供するDSSのテストILY体重は、信頼性および客観的な指標です。 - 結腸組織試料の組織学的評価のために、実験の終了時にCO 2通気（または国や機関のガイドラインで指定）によってマウスを安楽死させます。
2.実験セットアップDSS-大腸炎とのin vitro創傷治癒アッセイ
- 細胞培養および創傷治癒アッセイの確立。
- 37℃で95％湿度および5％CO 2環境でのCaco-2細胞を成長させます。 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI培地を使用します。
- ハイカルチャーインサートと35ミリメートルのペトリ皿に4×10 5細胞/ cm 2の密度でシードのCaco-2細胞（ 図4Aを参照してください）。
注：インサートは、分析されるべき創傷領域を表す定義されたセルの空き領域で分離された2つのセルカバーされるエリアを生成します。 - 2日seedin後に培地変更グラム。 、最初の自動ピペットを用いて、細胞の破片で残留培地を吸引することによって実行し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）100μlで洗浄し、新鮮なRPMI培地または無血清培地を追加します。
- 創傷治癒挙動の変化を検出するために、20 ngのEGF / mlの血清または2μgのマイトマイシンC / mlの血清を添加した無血清培地（0.1％FBS）中で24時間培養細胞。 24時間細胞を制御するために、通常のRPMI培地を追加します。
- 培養24時間後、削除して、ステップ3.4で説明したように培養インサートを破棄し、DHMを行います。
- 急性DSS大腸炎の誘導
- DSS溶液（w / v）の3％を得るために水をオートクレーブ100mlにDSSを3gを溶解します。 7日間のマウスを自由に飲料水の代わりにこのソリューションを提供します。マウス/日あたりDSS-溶液5mlを計算します。対照マウスを自由のためにDSSずにオートクレーブ処理水を提供します。
- マウスおよびヒトの結腸のcryostaticセクションの調製
- 実験の終了時にCO 2注入によるマウスを安楽死させます。
- 開腹23によって、動物の腹部を解剖。ピンセットを使って慎重に結腸全体を削除して、手術用はさみを使用して、回腸および直腸の端をカット。直腸最後まで盲腸から長手方向にハサミでコロンをカットし、コロンを開きます。 PBS 24で洗浄したピンセットを使用して試料からすべての糞を削除します。
- 内側に湾曲した粘膜と直腸最後に盲腸から長手方向芽綿と結腸全体をロールアップすることにより、スイスロールを準備します。最適な切削温度（OCT）化合物中に埋め込む結腸サンプルおよびさらなる使用まで-80℃で凍結しておきます。
- 最適な切削温度10月化合物中の手術標本からのヒト結腸組織を埋め込み、さらに使用するまで-80℃で凍結し続けます。
- cryotoの助けを借りて、OCT-化合物包埋標本の厚さ7μmのカットセクション直前に検査する私。
注：最適なサンプルの厚さは、永続性と調査中の組織型の散乱特性に依存します。結腸組織を使用して説明した実験のために、スライス厚の厚さのサンプルは、<5μmのはクライオ切断工程からアーティファクトを誘発損傷のためのより高いリスクを示しているが。> 10μmのは、原因で定量的DHMの位相コントラスト画像における光の散乱によるノイズの大幅な増加を引き起こします - ガラス物体キャリアのスライドへのセクションを転送します。
3.技術設備、デジタルホログラムの取得・評価のためのソフトウェアと手続き
- 定量的な細胞および組織のイメージングのためのデジタルホログラフィック顕微鏡
- 図1に示すように、生細胞イメージング25オフアクシスマッハツェンダデジタルホログラフィック顕微鏡システムを使用してください。顕微鏡は装備されていることを確認定量位相画像25のために37℃、ソフトウェアの生理的温度を維持するために10倍の顕微鏡レンズ、直径35mmのガラス物体キャリアスライドとペトリ皿のホルダーを有する顕微鏡のステージ、加熱室。
注：たとえば、ケンパーら 26とLangehanenberg ら 27に記載されているように。。。
注：別の方法として、明視野顕微鏡と生きている細胞および解剖組織スライドの定量位相イメージングを行うことができる同様のシステムを使用しています。 - きれいな顕微鏡レンズとレンズクリーニングペーパーやほこりまたは他の汚染物質を除去するために、顕微鏡の製造業者によって推奨されるように洗浄剤（ 例えば、エタノール）と凝縮。
- 白色光照明「オン」「明視野」撮像モードとスイッチを選択し、DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアを起動します。ケーラー-illuminを確認してください（代替的に、標準的な画像収集ソフトウェアがこのステップにおいて使用することができる）、画像取得ソフトウェアのライブイメージング窓内のサンプルを観察しながら、顕微鏡の製造業者によって推奨されるように試料のエーション。
注：画像強度は、視野内に均一に分布されるべきであり、試料位置は、顕微鏡のフォーカス駆動を有する光学リフォーカシング時に移動しないようにしてください。 - 「DHM「撮影モードを選択して、レーザー光」に「白色光照明とスイッチを「オフ」に。レーザ光 の照射が均一であることを確認してください（ すなわち 、光強度が均一DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアのライブイメージングウィンドウで配布されていること）とオフアクシスキャリア干渉縞のパターンがで十分なコントラストで表示されていることを確認撮影した画像（デジタルホログラム）。
- 図1に示すように、生細胞イメージング25オフアクシスマッハツェンダデジタルホログラフィック顕微鏡システムを使用してください。顕微鏡は装備されていることを確認定量位相画像25のために37℃、ソフトウェアの生理的温度を維持するために10倍の顕微鏡レンズ、直径35mmのガラス物体キャリアスライドとペトリ皿のホルダーを有する顕微鏡のステージ、加熱室。
- イメージングのための凍結切片の調製DHMと
- （：2.3で説明したように、7μmのガラス物体キャリア、厚さにクライオスタットセクション）を冷凍庫からサンプルを取ります。 RTおよび通常の大気中で約5分間のサンプルを解凍。
- それは完全にバッファに覆われるまで、ピペットを用いて組織切片上に媒体を埋め込むように100μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS） - 50を追加します。きれいなガラスカバースリップ（ガラス厚さ170ミクロン）でサンプルをカバーしています。
注：過剰乾燥試料の屈折率と散乱特性の有意な変化を誘導することができます。 - ガラスキャリアとカバースリップの底部が光散乱を誘発し得る埃や他の汚染から洗浄されることを確認してください。サンプルは、明視野顕微鏡とDHMと調査のための準備ができています。
- DHMで組織切片の定量的な位相画像
- デジタルホログラフィック顕微鏡のスイッチをオンにし、イメージングのための10Xの顕微鏡レンズを選択します。第一次戦略兵器削減条約DHM顕微鏡の魔道士取得ソフトウェアと明るいファイルの撮影モードを選択します。
- 顕微鏡の対物レンズに面したカバースリップで、顕微鏡スライドホルダーに）2で説明したように、組織スライドを置きます。
- DHM顕微鏡の明視野照明スイッチ「オン」。顕微鏡ステージにサンプルを置き、関心の組織領域がライブモニタリングウィンドウに表示されていることを確認してください。顕微鏡のフォーカス駆動を使用して、画像の鮮鋭度を向上させます。
注：だけでなく、関心のある領域は、組織のないスライドの面積も視野に存在すべきです。 - 画像取得ソフトウェアを使用して、急激に重点を置いた試料の明視野画像をキャプチャします。
- 「DHM「撮影モードを選択し、「オフ」白色光照明をオンにし、レーザー光の照射を「オン」に。 3ミリ秒以下、ホログラム記録のための「露光時間」を選択し、そのhologrを観察aphic軸外干渉縞は、画像取得ソフトウェアのライブイメージングのウィンドウで適切なコントラストで表示され、デジタルホログラムをキャプチャします。
- 明視野画像と異なるサンプル領域のデジタルホログラムの十分な数が記録されるまで3.3.5 - を繰り返し3.3.3手順。ホログラム買収が完了しました。
- DHMイメージングのための創傷治癒アッセイの調製
- DHM測定中に安定した温度条件を確保するために、実験開始前に3時間 - 約1 DHM顕微鏡のペトリ皿の加熱室に切り替えます。
- 必要な機器（2.3に記載されている創傷治癒アッセイのペトリ皿）とワークベンチを用意：ピペット、ピンセット、ペトリ皿用ガラス蓋、4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）は、生理的で、細胞培養培地を緩衝しました無菌環境での試料調製のための温度（37℃で）。
注記： 3で構成されています。 - ペトリ皿からプラスチック製のふたを取り外し、ピペットで細胞培養培地を除去します。ピンセットを使用して、ペトリ皿の底からカバーを取り外します。
- 死細胞および創傷領域の残りの細胞成分（ 例えば 、血清）を除去するために、バッファリング1ミリリットルのHEPES細胞培養培地で2回-サンプル1を洗ってください。 2ミリリットルを追加HEPESは、細胞培養培地をバッファリングし、ガラス蓋付きペトリ皿キャップ。
- ガラス蓋とペトリ皿の底が埃や他の汚染から洗浄されていることを確認してください。サンプルはDHMとタイムラプス観察の準備ができています。
- DHMを用いたin vitroでの創傷治癒の連続マルチモーダル監視
- 前3時間 - 約1 DHM顕微鏡のペトリ皿の加熱室に切り替え実験の開始にDHM測定中に安定した温度条件を確保します。
- デジタルホログラフィック顕微鏡「オン」スイッチは、イメージングのための10倍顕微鏡レンズを選択します。 DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアを起動し、「明視野」撮影モードを選択します。ペトリ皿のための加熱室は、生理的温度（37℃）で動作していることを確認してください。
- DHM顕微鏡の加熱室において、創傷治癒アッセイ4に記載のように調製）を用いてペトリ皿を置き。
- 明視野撮像モードを選択し、DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアのライブモニタリングウィンドウでそれを観察しながら、顕微鏡ステージにサンプルを置きます。サンプルの所望の領域が急激に白色光照明の下で集中表示されていることを確認します。
- 白下（コンフルエント細胞と創傷領域および周辺地域）のサンプルの異なる領域の明視野画像をキャプチャ画像取得ソフトウェア、文書の外観、細胞密度および均一性を有する光照明。
- DHM顕微鏡の「明視野」撮影モードを選択します。 DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアとのライブモニタリングウィンドウで白色光照明の下で、適切な創傷領域を選択してください。創傷領域は、死細胞と無血清遺跡から自由であることを確認し、双方は、好ましくは、直国境を持つ単一の均一な細胞層を、含まれていることを確認。
- DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアと明視野撮像モードでの最初の創傷領域の白色光画像をキャプチャします。
- 白色光照明を「オフ」に、レーザー照射」の「「DHM」モードとスイッチを選択します。ホログラム記録については、以下の3ミリ秒の露光時間（干渉縞がトンの画像取得ソフトウェアのライブイメージングウィンドウで十分なコントラストで表示されるホログラフィック軸外の観察を選択彼は顕微鏡をDHM）とデジタルホログラムをキャプチャします。
- 画像取得ソフトウェアでDHMモードでサンプルホログラムをキャプチャし、画像品質を確認するためにDHM顕微鏡の再構築ソフトウェアで定量的な位相画像を再構成します。
- DHM顕微鏡の画像取得ソフトウェアでタイムラプスホログラム取得のための- （5分例えば 、3）適切な時間遅延を選択します。
- サンプルのみホログラム取得中にレーザ光を照射する画像取得ソフトウェアのタイムラプス取得モードを選択します。
- 創傷治癒アッセイのタイムラプスDHM観測を開始します。
- 意図した時間後にタイムラプス買収を停止し、明視野撮像モードを選択して、白色光イメージング下でのサンプルの最終的な外観を文書化します。
- 解剖組織のデジタルホログラムを再構築し、定量化するためのパラメータとして平均屈折率を決定します組織密度
- ケンパーら 26とLangehanenberg ら 27に記載されているように、 例えば DHM顕微鏡のソフトウェアとの解剖組織のデジタルホログラムから定量的位相画像を再構成します。
- 利益（ROIを）19の適切に選択された領域内の異なる組織層（上皮、粘膜下組織、間質）の平均位相差Δφを決定します。
- 屈折計を使用して、またはその代わりに、文献から適切な値を使用することにより包埋媒体の屈折率を決定します。 （典型的な埋め込 みメディアの屈折率の値：nは水 = 1.334 28、nはリン酸生理食塩水（PBS）= 1.337 29、n個の細胞培養培地 = 1.337から1.339 29,30を バッファリング ）。
- 平均位相差19値は異なる組織層の屈折率を算出します
注：式で。 、解剖組織の厚さD（ここでは7ミクロン）：1λ（λ= 532 nmのここ）は、レーザ光 の波長であり、nは媒体がここに包埋媒体（の屈折率： 中 = nのPBS のn = 1.337、アッベ屈折計により測定）。
- 再構築し、一連の観測創傷治癒タイムラプスからデジタルホログラムを評価
- DHM顕微鏡ソフトウェア26,27と創傷治癒の観察中に得られた時間経過ホログラムシリーズから定量的位相画像を再構成します。
- 最大位相コントラストの画像に定量的位相画像の各シリーズを正規化します。
- 当たりできる画像セグメンテーションによって定量DHMの位相画像中の細胞によって覆われる面積S cを決定しますフリーソフトウェアセルプロファイラを用いて形成された（www.cellprofiler.org 31）。
- 面積S CのセルΔφ セルの平均位相差を計算します。
- 面積S C 15の平均位相差Δφ 細胞から細胞乾燥質量DMを取得
（2）
注：2 DMは細胞乾燥質量を表す式では、S cは 、細胞およびα= 0.002メートル2 /キログラムによって占有される領域を示しています。 - 一体型携帯屈折率n 細胞および細胞培養培地nは 媒質の屈折率を決定します。 30で説明したように懸濁した細胞とは別に実験的にn個の セルを決定し、屈折計を有するn 媒体を測定します 。オルタナtively n個の セル 30とn の媒体 29,30のための文献値を使用します。
- λ、Δφ セル 、n個 の細胞から平均セル厚d セルを計算し、nは 媒質 26,32
（3）
注：式で。 3パラメータd 細胞が平均セル厚さ、λは、レーザ光 の光波長を表すΔφ セル平均位相差を表し、nはセルおよびn 媒体積分セルラ屈折率と周囲の媒体の屈折率です。
（2） 
（3） Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
デジタルホログラフィック顕微鏡用DHMイメージングのための典型的なセットアップ（DHM）
図 1Bに示すように、明視野イメージングおよび定量DHM位相コントラスト撮影を行うために、我々は、倒立顕微鏡を適用しました。 25前述したように、システムは、DHMモジュールを取り付けることによって修正されました。マッハツェンダー構成（ 図 1 A）におけるYAGレーザλ= 532nm）をディジタルホログラムを照明することにより、周波数倍増Ndを光で試料を作製しました。解剖組織をガラスキャリアスライド上にエクスビボで分析しました。 図 1 のCに示すように、生細胞培養物を観察し、創傷治癒のための特別なペトリ皿で観察されました。サンプルは10倍マイルを経由して透過照明で画像化しました。croscopeレンズ（NA = 0.3）とチューブレンズ。電荷結合素子カメラは、わずかに傾いた参照波とサンプル画像（物体波）を重畳して生成された干渉パターン（デジタル軸外ホログラム）を記録するために使用しました。デジタルで撮影したホログラムは、オプションのホログラフィックオートフォーカス26,33と組み合わせて再構成をシフトする空間位相によって再構築しました。
DHMによるマウスDSS誘発大腸炎の評価
急性大腸炎は、5日間の飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）w / vの3％の投与によりマウスにおいて誘発しました。大腸炎の症状および経過は対照群と比較して、DSS処置群における進行性の体重減少をモニターすることによって追跡しました。 （ 図 2 のAは 19から適応しました）。内視鏡的に、重度の大腸菌への中等度結腸壁の肥厚、血管パターン（ 例えば、自然出血、 赤矢印 ）、フィブリン滲出（ 白矢印 ）および粘膜表面（ 図2B）の粒度の変化によって反映されるようにTISが観察されました。ヘマトキシリンおよびエオシンの従来の組織学的評価（HE）は、結腸のセクションでは、主に粘膜下層（ 図 2 C 灰色の矢印 ）に配置された制御動物、詩DSS処置の結腸壁に著しい浮腫を明らかにした染色しました。式1によって取得定量DHM位相コントラスト画像と関連する屈折率マップの対応、また、上記組織の変化を描きました。また、256階調にコード化された屈折率は、天然の、未染色組織サンプル中の上皮（ 白矢印 ）および間質（ 黒矢印 ）（ 図 2を含む組織層の濃度の違いを示しましたC）。屈折率が大幅に上皮内だけでなく、健康な対照（ 図 2 E）に比べて大腸炎マウスの粘膜下組織と間質に減少しました。さらに、臨床パラメータ（体重の相対損失）と絶対物理的パラメータ（屈折率）との間に有意な相関が観察できた（R 2リニア= 0.64; 19から適応図 2 D）。
DHMによってヒトにおけるクローン病の評価
クローン病は、多くの場合、消化管内視鏡検査によって検出された腸管壁の著しい炎症性の変化によって識別されます。特性巨視的な特徴は、粘膜表面の粒度のフィブリンexudatと長手方向に潰瘍を含み、イオンおよび自発的出血（ 図 3A）（また、「カタツムリ証跡」と呼びます）。アクティブなCDを有する患者由来の組織試料のHE染色による組織学的評価は、多くの場合、結腸壁だけでなく、粘膜下浮腫を明らかにしました。対応する定量的DHMの位相コントラスト画像と数式1で取得した関連屈折率マップもここ上皮（ 図 3 B）に見られる、結腸壁の炎症媒介強化/むくみを検出しました。また、絶対的なパラメータとして、屈折率が、また大幅にすべての壁層（上皮、粘膜下層および間質）に減少したアクティブなCDを有する患者由来の結腸組織試料における寛解（ 図 3 C）におけるそれらの詩。
-インビトロ 創傷治癒のマルチモーダルモニタリング
Caco-2細胞は、アッセイは標準化された条件を提供するために、特別なペトリ皿を使用して実施した創傷治癒します。皿を500ミクロン（ 図 4 A）のギャップによって分離された2つの異なるチャンバを形成するカルチャーインサートが装備されています。異なる生理学的環境をシミュレートするために、細胞は、上皮成長因子（EGF）によって刺激またはマイトマイシンCで阻害、処置なしのいずれかを調べました。 DHMのセットアップは、実験開始（ 図 4 B）の後に0、22.5および45時間後（256階調にコード化された）代表的な定量的DHM位相コントラスト画像によってここに示されている時間をかけて、創傷治癒プロセスの継続的な監視を可能にします。 図 5 の対応する偽色コード化された擬似3Dプロットは、三ディにおける細胞層の厚さの空間的な発展を示してmensions。光路長の遅れ、細胞の屈折率と、式2および図3に基づいて、DHMは、細胞覆われた表面積、平均セル厚さおよび細胞乾燥質量（のような細胞の特性の経時的なモニタリングによって遊走、増殖及び形態の同時動的な評価を可能にします図 4 のC）。要約すると、 図 4のデータは、増大した平均セル厚さと対照細胞と比較して、視野内のより高い乾燥質量で、創傷領域への細胞のより速い移動にそのEGFシミュレーション結果を示します。阻害細胞がカバーcは対照的に、マイトマイシンは少し実験中、対照細胞よりも表面積が減少し、また、わずかに低い乾燥質量の増加を示します。しかし、平均セル厚さは明らかに両方、刺激および対照細胞と比較して減少したが表示されます。
図1。 デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）。DHMワークステーション（A）の概略セットアップのためのオフ軸セットアップ活用 。顕微鏡の設定（モニタ、ライブ画像と制御ソフトウェア（1）を示す写真を対応するオフアクシスセットアップデジタルマイクロスコープ（2）、（B）、顕微鏡（ 緑色の点線 ）とサンプルの光路は、 赤色で示され（ 矢印 ;（C））。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2。 DHMによるマウスDSS誘発大腸炎の評価。大腸炎のコースは毎日私が続きました相対的な体重と繰り返し、内視鏡のフォローアップ検査のasurement。 （19から適応）DSS投与（A）の開始後4日目からの相対的な体重の大規模な損失が焦点潰瘍および粘膜の脆弱性（B）を含む、確立された大腸炎の内視鏡的兆候を伴っていました。従来のHE染色cryostaticセクションの分析は、粘膜下浮腫、筋層の肥厚や粘膜の顕著な粘膜の炎症性浸潤を明らかにしました。式1で取得した定量的DHM位相コントラスト画像と関連する屈折率マップを対応する（256階調にコード化された）炎症過程の間に粘膜下組織の浮腫性変化を確認した（C）（白矢印は上皮、灰色の粘膜下層と黒の間質を示しています）。有意屈折率（絶対的な物理的なパラメータ、R 2リニア= 0.6と相関体重（臨床的パラメーター）の相対的な喪失4;大幅上皮ならびに粘膜下組織と健常対照と比較して、大腸炎マウスの間質に減少した19から適応（D）は 、）、（平均±SEM、*** P <0.001; E） をクリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
DHMによってヒトにおけるクローン病の 図 3. 評価。内視鏡および組織学的に確認されたクローン病の患者からの結腸組織サンプルを検査した（A）。 HE染色は、粘膜陰窩の延長および炎症性細胞の著しい浸潤を示しました。また、粘膜下浮腫および固有筋層の拡大が検出されました。 CORRの分析式で検索された定量的なDHM位相コントラスト画像と関連する屈折率マップをesponding（1）（256階調に符号化された）は、上皮（B）中の（ここでは白と黒の星で示す）浮腫の変化を明らかにしました。平均屈折率の有意差は、アクティブフレア（ クリア棒 ）または寛解（ 黒棒 ）とCD患者からのサンプルで検出されました。 。;これらの違いは、各組織タイプ（C平均±SEM、*** P <0.001）に見られるこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ホワイトライト顕微鏡とDHMによって上皮創傷治癒の 図 4. 監視。培養細胞はトランました特殊なインサート（ 赤い矢印 ）でペトリ皿にsferred。培養インサートが除去される前に、細胞を24時間、EGFまたはマイトマイシンCのいずれかで処置された、または培地単独（無刺激対照）（A）で処理しました。培養インサートを除去した後、創傷治癒を連続的に経時DHMによる位相コントラストイメージングによってモニターしました。セルの輪郭を明確に認識することができました。代表的な定量DHM位相コントラスト画像は、22.5時間後および45時間（B）後に測定の終了時に、実験の開始時に示されています。パネル（C）は 、細胞で覆われた表面の対応する時間的変化（S c）が 、平均セル厚（D 細胞 ）および細胞乾燥質量（DM）を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 5。 定量的DHM位相コントラスト画像の 偽色コード化された擬似 3 次元プロット による細胞層形態変更のイラスト 。t = 0で、図4（b）の定量的DHM位相コントラスト画像の代表的な偽色分けされた擬似3Dプロット、22.5時間後と45時間後の測定の終了時に、制御-のための細胞層の厚さの空間的な発展を示して、マイトマイシンは、c-阻害し、3DでのEGF刺激された細胞。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、DHMは、ex vivoでのマウス大腸炎モデルおよびヒトの結腸組織試料における組織学的損傷の正確な評価を提供することを実証している。また、我々は、DHMが連続的に同時に携帯の変化についてのマルチモーダル情報を提供しながら、上皮創傷治癒を監視することができます示します。 DHMでは、デジタルで撮影したホログラムの再構成が数値的に32に行われます。従って、明視野顕微鏡、ゼルニケ位相コントラストおよび微分干渉コントラスト顕微鏡法と比較して、DHMは、任意の後続の数値焦点補正（多焦点画像）27との定量的な位相差を提供します。定量位相イメージングは、光路長の変化の決意に基づいており、従って、使用測定器の高度に無関係です。これは、異なる機器で取得された測定データの比較が簡単になります。また、DHMはオブジェのための唯一の低光強度を必要としますCT照明。これは、未染色解剖組織の低侵襲性の分析を可能にし、生きた細胞の長期的タイムラプス観察の際に必要なサンプルの相互作用の量を最小限に抑えることができます。
IBDの治療装備一式が大幅に2最後の十年にわたって広がっています。 UC及びCDの両方に有効であり、許容可能な副作用プロフィールを有する抗TNF-α療法の導入に加えて、新規およびインテグリンを標的とする特異的な抗体は、最近臨床診療34-37に導入しました。他のいくつかの有望な薬剤は現在、IBD 38-40でそれらの治療有効性について評価されています。しかしながら、ヒトでの臨床使用の前に、これらの潜在的な治療法の有効性および安全性は、動物実験で証明されなければなりません。 DSS誘発大腸炎は、その高い再現性と低コストの23に、最も頻繁に使用されるマウス大腸炎モデルの一つです。さらに、このモデルは、缶アルそのように遺伝子改変マウスに適用される41菌株 。全身マーカーは、 例えば、CRPは、動物モデルにおいて非常に可変であるが、大腸の組織学的評価は、疾患の重症度42,43を評価するための最も有効なアプローチを示します。それにもかかわらず、スコアリングシステムに従って組織学的炎症の定量的な評価は、研究者の専門知識と経験に大きく依存しています。 DHMと可能な限り客観的なパラメータによる自動評価とスコアリングは、これらの制限を克服し、さらに19を染色するための必要性を回避すること、また、時間の節約です。また、DHMは、内視鏡検査の間に得られた外科結腸標本、ならびに粘膜サンプルを検査するために使用することができます。
上皮再生および創傷治癒は、消化管潰瘍や縫合不全を含むいくつかの病理学的プロセスの間に極めて重要なメカニズムです。 Vにおける上皮創傷治癒を評価するための有望なアプローチであるがIVO 44は 、これらの技術は、洗練された検査ツールを必要とし、現在広く使用できません。したがって、現在の上皮治癒は一般的に、インビトロ 9 にスクラッチアッセイによって調査されています。これらのアッセイは、創傷閉鎖の有効な検査を可能にするが、通常は最初繰り返さ評価10,45を防ぐ細胞染色を、必要とします。また、いかなる細胞改変データは、この実験と並行して取得することができません。アポトーシスおよび壊死46を区別するために、細胞の増殖及び遊走46を評価することができるので、この情報は非常に重要であってもよいです。したがって、セル厚を決定する可能性は、DHM検査によって同時に創傷閉鎖の監視に乾燥質量または組織密度は、粘膜研究に高い価値があります。
ヒトのIBD患者のための治療目標は、常に最後の数十年にわたって変更されています<SUP> 47。最初は炎症の制御が最も重要であると見なされていたが、後にステロイドフリー寛解となりました粘膜治癒は、治療48の主要な目標です。最近では、組織学的寛解があっても一人で49治癒粘膜より優れ得ることを仮定しました。人間IBDのために利用可能ないくつかの組織学的スコアリングシステムがありながらしかし、観察者間の変動性は高い50のまま。したがって、組織学的結腸試料の評価のための標準化されたアプローチが必要です。 DHMは、この目標に貢献するかもしれないし、さらに、ヒトIBD患者と前向き臨床試験で評価されるべきです。
提示された実験手順では、試料は、非常にコヒーレントなレーザ光を用いて照射し、画像化されます。したがって、DHMの解像度は主にサンプル照明の位置ずれによる光の散乱や回折効果によって制限され、厚いサンプル、ほこりやこのような光路内の凝縮水のような他の不純物。定量DHMの位相コントラスト画像から精度の高い測定データを得るために、DHMセットアップおよびサンプルを注意深く調製と整合プロトコルの中で最も重要なステップです。十分に洗浄光学撮像素子、特に顕微鏡コンデンサーと顕微鏡対物レンズは、ノイズを最小化するために必要とされます。また、サンプルキャリアスライド、ペトリ皿の蓋と底部、ならびに使用の細胞培養培地は、粒状不純物を含まないべきです。これは慎重に適用される液体のすべてのコンポーネントと十分なフィルタを洗浄することによって達成されます。
デジタルホログラムおよび/または解剖組織の定量的DHMの位相画像にノイズがある場合には、ガラスキャリアとカバースリップがほこりで汚染されることがあります。より詳細なトラブルシューティングのヒントは以下のとおりです。もしそうであれば、アルコール（ 例えば、純エタノール）でガラスキャリアとカバースリップを清掃してください。厚い場合解剖組織のネスは、より薄い組織切片を使用してみてください、光の散乱の大きすぎる（> 10ミクロン）、したがって結果です。レーザー光で照明が均一に分布されていない場合には、顕微鏡コンデンサーを経由してオブジェクトの照明を揃えます。ガラス蓋の底部に凝縮水が散乱効果誘発する場合は、加熱室の温度と室内湿度をチェックしてください。場合において、細胞密度は、創傷治癒アッセイの準備中に細胞密度を減少させる、複数の層に高すぎる、または細胞増殖です。 DHMは、干渉の原理に基づいているように、最終的に、この方法は、個々の実験室環境に応じて変化する振動や他の機械的な外乱に敏感です。しかしながら、そのような影響は、通常、実験の準備中にホログラフィー記録用に適切に選択された露光時間（典型的には、ミリ秒の範囲の以下）によって最小化することができます。
要約すれば、我々の結果は、定量的にほぼ自動化された方法で組織学的炎症ex vivoでの評価する能力にDHMは、明視野と、このようなゼルニケ位相コントラストやDICなどの既存の位相コントラストイメージング顕微鏡技術を超える大きな利点を保持していることを示しています。さらに、DHMは、サンプルとの最小化の相互作用を用いたin vitroでの上皮創傷治癒のラベルフリー連続マルチモーダルな評価を可能にします。これは、IBDを有する患者にDHMの翻訳可能性を探るために ''デジタル病理学 ''とさらに拡張研究の面で自動化された組織学的検査への道を開きます。また、DHMは、インビトロ定量的に細胞遊走、形態および増殖を勉強する機会小説を提供しています。
臨床診療へのDHMの翻訳は、IBDの診断を改善する可能性があります。 DHMは、腸炎を介して異なる程度の定量化を可能にするように「デジタル病理」の意味での濃度変化、疾患の客観的かつより正確な評価のような物理的なパラメータが可能なようです。客観的な評価は、IBD患者の臨床管理に重要な影響を持つことができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Azoxymethane (AOM) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 | |
| Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| DMEM/Ham's F12 | PAA Laboratories - Pasching - Austria | E15-813 | |
| EGF | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| Mitomycin C | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 | |
| Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 | |
| DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 | |
| Equipment | |||
| MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 | |
| Digital holographic microscope | |||
| Component | Model | Company | |
| Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany | |
| Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany | |
| Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany | |
| CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
- Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
- Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
- Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
- Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
- Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
- Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
- Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317 (2014).
- Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
- Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017 (2011).
- Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210 (2015).
- Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
- Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
- Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
- Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
- Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B.
- Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
- Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
- Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
- Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
- Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
- Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
- Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
- Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912 (2012).
- Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
- Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
- Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
- Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).
