"Phagosome Clôture Assay" pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
La phagocytose est une fonction cellulaire importante qui commence par la reconnaissance et la liaison de matière à la surface des récepteurs, ce qui conduit alors à l'internalisation et la dégradation de la matière ingérée. Alors que les eucaryotes unicellulaires tels que le moule Dictyostelium discoideum et amibes utilisent phagocytose pour l' alimentation sur les bactéries, les organismes supérieurs ont évolué avec des cellules professionnelles. Macrophages ou les cellules dendritiques sont la première ligne de défense contre les agents pathogènes dans divers tissus et organes, et sont essentiels pour activer le système immunitaire adaptatif par la présentation de l' antigène et la production de cytokines 1-4. Dans certaines circonstances , la phagocytose peut être effectuée par des cellules phagocytaires non professionnelles, par exemple, les cellules endothéliales et épithéliales. Ce processus est important pour maintenir l'homéostasie au cours du développement et à l'âge adulte pour le chiffre d'affaires des tissus normaux et le remodelage. phagocytes Enfin, spécialisés tels que les cellules de Sertoli dans le testicule ou rétinienneles cellules épithéliales pigmentaires sont extrêmement puissants phagocytes 5.
La formation d'un phagosome où la dégradation des micro-organismes ou des débris cellulaires se produit commence par le regroupement des récepteurs phagocytaires sur la surface de la cellule phagocytaire. les événements de signalisation en aval des récepteurs suivants regroupement opsoniques tels que les récepteurs Fc (FcR) ou compléter les récepteurs (CR) ont été bien caractérisés. Cependant, il y a aussi de nombreux récepteurs non-opsoniques y compris les récepteurs Toll-like (TLR), des lectines, des récepteurs mannose et les récepteurs scavenger. Ces récepteurs reconnaissent les déterminants sur la surface des particules telles que des résidus de mannose ou fucose, la phosphatidylsérine et des lipopolysaccharides 1,6-9.
la reconnaissance des pathogènes ou des débris cellulaires implique la liaison et le regroupement de plusieurs types de récepteurs phagocytaires, qui mènent ensuite à un remodelage intense et transitoire de l'actine. En parallèle, l'exocytose focal du Compartiment à intracellulairets contribue à la libération de la tension de la membrane et est importante pour la phagocytose efficace des grosses particules. Les événements de signalisation conduisant à la polymérisation et de la membrane de déformation actine ont été disséqués dans des modèles expérimentaux qui ont déclenché un seul récepteur phagocytaire. Au cours de la phagocytose FcR-médiée, il y a polymérisation de l'actine intense qui est réglementée par les petites GTPases (Rac, Cdc42). Parmi les effecteurs en aval, la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich (WASP) conduit à l' activation de l'Actine-protéine associée au complexe 2/3 (Arp2 / 3) qui nucléation filaments d'actine 1,2,4,10. La production locale de phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) est crucial pour la polymérisation de l' actine initial qui entraîne la formation de pseudopodes. Sa conversion en PI (3,4,5) P 3 est nécessaire pour l' extension pseudopode et phagosome fermeture 11. Plusieurs voies contribuent à la disparition de PI (4,5) P2. Tout d'abord détachement de phosphatidylinositol phosphate kinaSES (PIPKIs) de l'arrestation de phagosome PI (4,5) P2 synthèse. En second lieu , il peut être phosphorylée et consommé par PI3K de classe I kinase (PI3K) et convertie en PI (3,4,5) P3 12. Un rôle pour phosphatases et phospholipases a également été impliqué dans PI (4,5) P 2 hydrolyse et élimination F-actine lors de la phagocytose dans les cellules de mammifères et Dictyostelium 13,14. La phospholipase C (PLC) δ hydrolyse PI (4,5) P2 en diacylglycérol et le phosphate de tris inositol-1,4,5-. La phosphatase OCRL PI (4,5) P2 et PI (3,4,5) P3 (Syndrome de Lowe de Lowe) a également été impliquée dans la formation du phagosome. formation locale précise de F-actine et son dépolymérisation est étroitement régulée dans l'espace et le temps et nous avons montré que le recrutement des compartiments intracellulaires est important de fournir localement la phosphatase OCRL, contribuant ainsi à la dépolymérisation de l'actine locale à la base de la coupe phagocytaire <sup> 13,15. Pour cela, nous avons utilisé le expérimental a décrit ici.
Les joueurs de mécanisme et moléculaires nécessaires à la clôture de phagosome et de scission membrane restent mal définies en raison des difficultés à visualiser et surveiller le site de la fermeture de phagosome. Jusqu'à récemment, la phagocytose a été observée sur des cellules fixes ou vivant qui internalisent des particules sur leur face dorsale ou sur leurs côtés, ce qui rend la visualisation en temps opportun du site de phagosome fermeture difficile. En outre, les méthodes de fixation pourraient provoquer la rétraction des membranes et biaiser les résultats sur l'extension de pseudopodes et la fermeture. En revanche, le test que nous avons mis en place et de décrire ici nous permet de visualiser l' extension pseudopode et l'étape de fermeture de la phagocytose dans les cellules vivantes 13, basée sur la microscopie interne totale de réflexion (TIRFM) 16. Cette technique optique utilise une onde évanescente pour exciter les fluorophores dans une zone mince à l'interface entre un transparent, de sortecouvercle (lamelle) et un liquide (milieu de culture cellulaire). L'épaisseur de la profondeur d'excitation est d'environ 100 nm à partir de la surface solide, ce qui permet la visualisation des événements moléculaires à proximité de la membrane plasmique. TIRFM permet un rapport signal-bruit de fond, et limite la fluorescence hors-focus collectées et la cytotoxicité due à l'éclairage des cellules.
En profitant de la TIRFM, on a développé le "dosage de fermeture phagosome", dans lequel les lamelles sont activées par la poly-lysine et ensuite revêtue de globules rouges opsonisés IgG (IgG-GRM). Macrophages exprimant des protéines transitoirement marquées par fluorescence d'intérêt sont alors autorisés à engloutir les IgG-GRM. Alors que les cellules se détachent les particules cibles qui ne sont pas liés de façon covalente à la surface du verre, les pointes des pseudopodes peuvent être observés et enregistrés en mode TIRF. acquisitions TIRF sont combinées avec des acquisitions dans le mode épifluorescence, après le passage du stade 3 um ci-dessus, qui permet à la visualization de la base de la coupe phagocytaire. L'addition de médicaments pharmacologiques tels que ceux inhibant actine ou dynamine au cours du processus est également possible de disséquer le processus au niveau moléculaire.
Le protocole décrit en détail ici est une lignée cellulaire de macrophages murins RAW264.7 et des particules opsonisées, mais pratiquement, il peut être adapté à toute autre cellule phagocytaire et avec d'autres cibles telles que des billes. Cette méthode permettra de mieux caractériser la régulation dans le temps et l'espace des acteurs moléculaires impliqués dans l'extension pseudopode et la fermeture de phagosome lors de divers processus phagocytaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
