"Fagossomo Encerramento Ensaio" para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Fagocitose é uma função de célula grande que começa com o reconhecimento e ligação de material para a superfície receptores, que depois leva à internalização e degradação do material ingerido. Enquanto eucariotas unicelulares como o Dictyostelium discoideum molde e amebas usar fagocitose para a alimentação de bactérias, organismos superiores evoluíram com células profissionais. Os macrófagos ou células dendríticas são a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos em vários tecidos e órgãos, e são cruciais para activar o sistema imunitário adaptativo através de apresentação de antigénio e produção de citocinas 1-4. Sob certas circunstâncias a fagocitose pode ser realizada por células fagocíticas não profissionais, por exemplo, células endoteliais e epiteliais. Este processo é importante para manter a homeostase durante o desenvolvimento e na vida adulta de renovação do tecido normal e de remodelação. fagócitos Finalmente, especializados, tais como células de Sertoli nos testículos ou da retinanas células epiteliais pigmentares são extremamente potentes fagócitos 5.
A formação de um fagossoma onde a degradação de microrganismos ou fragmentos celulares ocorre começa com o agrupamento de receptores fagocíticos na superfície da célula fagocítica. eventos de sinalização a jusante seguintes agrupamento de receptores opsónicos, tais como receptores Fc (FcR) ou receptores de complemento (CRS) têm sido bem caracterizadas. No entanto, também existem numerosas receptores não-opsónicos incluindo receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectinas, receptores de manose e receptores scavenger. Estes receptores reconhecem determinantes sobre a superfície das partículas, tais como resíduos de manose ou fucose, fosfatidilserina, e lipopolissacarídeos 1,6-9.
Agente patogénico ou fragmentos de células de reconhecimento envolve a ligação ao agrupamento e de vários tipos de receptores de fagocitária, que, em seguida, conduzir a uma intensa e transiente remodelação da actina. Em exocitose paralelo, focal de compartmen intracelularTS contribui para a libertação da tensão da membrana e é importante para a fagocitose eficiente de grandes partículas. Os eventos de sinalização que levam à deformação de polimerização e membrana actina foram dissecados em modelos experimentais que desencadearam um único receptor fagocítica. Durante a fagocitose FcR-mediada, há intensa polimerização de actina, que é regulada por pequenas GTPases (Rac, Cdc42). Entre os seus efectores a jusante, a proteína síndroma de Wiskott-Aldrich (WASP) conduz à activação da proteína relacionada com a actina 2/3 complexo (Arp2 / 3) que nucleia 1,2,4,10 filamentos de actina. A produção local de fosfatidilinositol-4, 5-bifosfato (PI (4,5) P 2) é crucial para a polimerização de actina inicial que dirige a formação pseudópode. Sua conversão em PI (3,4,5) P 3 é necessário para a extensão pseudopod e fechamento fagossomo 11. Diversas vias de contribuir para o desaparecimento de PI (4,5) P 2. Em primeiro lugar destacamento de fosfatidilinositol kina fosfatoses (PIPKIs) do PI prisões fagosoma (4,5) P 2 síntese. Em segundo lugar, pode ser fosforilada e consumido por PI3K de classe I-quinases (PI3K) e convertido em PI (3,4,5) P 3 12. Um papel para fosfatases e fosfolipases também tem sido implicado em PI (4,5) P 2 hidrólise e remoção de F-actina durante a fagocitose em células de mamífero e em Dictyostelium 13,14. O δ fosfolipase C (PLC) hidrolisa PI (4,5) P 2 em diacilglicerol e fosfato de tris-inositol-1,4,5-. O OCRL PI (4,5) P 2 e PI (3,4,5) P 3 fosfatase (síndrome oculocerebrorrenal de Lowe) também tem sido implicado na formação do fagossoma. formação local preciso da F-actina e sua despolimerização é estreitamente regulada no espaço e no tempo e temos demonstrado que o recrutamento de compartimentos intracelulares é importante para entregar localmente a fosfatase OCRL, contribuindo assim para a despolimerização de actina locais na base do copo fagocitária <sup> 13,15. Para isso, utilizou-se o conjunto experimental descrita aqui.
Os jogadores mecanismo e moleculares necessários para o encerramento fagossomo e cisão da membrana permanecem pouco conhecidos devido às dificuldades em visualizar e monitorar o local de encerramento fagossomo. Até recentemente, a fagocitose foi observado em células fixas ou vivos que internalizam partículas na face dorsal ou em seus lados, tornando a visualização em tempo útil do local de fechamento fagossomo difícil. Além disso, métodos de fixação pode causar retração de membranas e enviesar os resultados na extensão pseudópodos e encerramento. Em contrapartida, o ensaio que criámos e descrever aqui nos permite visualizar a extensão pseudopod ea etapa de encerramento da fagocitose em células vivas 13, com base em microscopia interna total reflexão (TIRFM) 16. Esta técnica utiliza óptica uma onda evanescente para excitar fluoróforos numa zona fina na interface entre um modo transparentetampa (lamela) e um (meio de cultura de células) de líquido. A espessura da profundidade de excitação é de cerca de 100 nm a partir da superfície sólida, permitindo a visualização de eventos moleculares perto da membrana plasmática. TIRFM permite uma elevada relação de sinal-para-fundo, e limita a fluorescência para fora de foco recolhida e a citotoxicidade devido à iluminação de células.
Tomando vantagem de TIRFM, foi desenvolvido o "ensaio de encerramento fagossoma" em que lamelas são activados com poli-lisina e, em seguida, revestida com as células vermelhas do sangue de IgG-IgG-opsonizados (SRBCs). Macrófagos que expressam proteínas transitoriamente fluorescente etiquetado de interesse são, então, autorizado a engolir as IgG SRBCs. Enquanto as células separar as partículas que são alvo não-ligado de forma covalente à superfície do vidro, as pontas dos pseudopods podem ser observadas e registadas no modo de TIRF. aquisições TIRF são combinados com aquisições no modo de epifluorescência, após o deslocamento da uM fase 3 acima, o que permite a visualization da base do copo fagocítica. A adição de drogas farmacológicas, tais como os da inibição da actina ou dinamina durante o processo também é possível, para dissecar ainda mais o processo, a nível molecular.
O protocolo descrito em pormenor aqui é para uma linha celular de macrófagos de murídeo e RAW264.7 partículas opsonizadas, mas virtualmente, ele pode ser adaptado a qualquer outra célula fagocítica e com outros objectivos, tais como esferas. Este método permitirá uma melhor caracterização da regulação no tempo e no espaço dos jogadores moleculares envolvidos na extensão pseudopod e fechamento fagossoma durante vários processos fagocíticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
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