"Phagosomen Closure Assay" zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Phagozytose ist eine wichtige Zellfunktionen, die mit der Erkennungs beginnt und die Bindung von Material an Oberflächenrezeptoren, die dann führt zur Internalisierung und Degradation des aufgenommenen Materials. Während einzelliger Eukaryonten, wie die Form Dictyostelium discoideum und Amöben für Fütterung auf Bakterien Phagozytose verwenden, haben höhere Organismen mit professionellen Zellen entwickelt. Makrophagen oder dendritischen Zellen sind die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger in verschiedenen Geweben und Organen und sind entscheidend für die adaptive Immunsystem durch Antigenpräsentation und Zytokin – Produktion 1-4 zu aktivieren. Unter bestimmten Umständen können die Phagozytose von nicht-professionellen Phagozyten durchgeführt werden, zum Beispiel Endothel- und Epithelzellen. Dieser Prozess ist wichtig für die normale Gewebeumsatz und Umbau Homöostase während der Entwicklung und im Erwachsenenalter zu halten. Schließlich spezialisierte Fresszellen wie Sertoli-Zellen in den Hoden oder retinalenPigment – Epithelzellen sind extrem potente Phagozyten 5.
Die Bildung eines phagosome wo Abbau von Mikroorganismen oder Zellabfall auftritt beginnt mit der Clusterung von phagozytischen Rezeptoren auf der Oberfläche der phagozytischen Zelle. Downstream Signalereignisse folgende Häufung von opsonischen Rezeptoren wie Fc-Rezeptoren (FcR) oder Komplement-Rezeptoren (CRs) wurden gut charakterisiert. Allerdings gibt es auch zahlreiche nicht-opsonischen Rezeptoren, einschließlich Toll-like Rezeptoren (TLR), Lektine, Mannose-Rezeptoren und Scavenger-Rezeptoren. Diese Rezeptoren erkennen Determinanten auf der Partikeloberfläche , wie beispielsweise Mannose oder Fucose – Reste, Phosphatidylserin und Lipopolysaccharide 1,6-9.
Pathogen oder Zelltrümmer Anerkennung beinhaltet die Bindung an und Clustering von mehreren Arten von phagozytischen Rezeptor, der dann zu intensiv und vorübergehende Aktin-Umbildung führen. Parallel dazu Brenn Exozytose von intrazellulären ABTEILUNGts trägt zur Freisetzung von Membranspannung und ist für eine effiziente Phagozytose von großen Teilchen wichtig. Die Signalereignisse zu Aktin-Polymerisation und Membranverformung führen, wurden in experimentellen Modellen seziert, die einen einzelnen phagozytischen Rezeptor ausgelöst. Während FcR-vermittelte Phagozytose, gibt es intensive Aktin-Polymerisation, die von kleinen GTPasen (Rac, Cdc42) geregelt wird. Unter ihren nachgeschalteten Effektoren führt das Wiskott-Aldrich – Syndrom – Protein (WASP) zur Aktivierung des Actin-Related Protein 2/3 Komplex (Arp2 / 3) , die Aktinfilamente 1,2,4,10 nukleiert. Die lokale Produktion von Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) ist von entscheidender Bedeutung für die anfängliche Aktin – Polymerisation , die pseudopod Bildung antreibt. Die Umstellung auf PI (3,4,5) P 3 ist für pseudopod Verlängerung und phagosome Verschluss 11 erforderlich. Mehrere Wege beitragen 2 zum Verschwinden von PI (4,5) P. Zum einen Ablösung von Phosphatidylinositol Phosphat Kinases (PIPKIs) von der phagosome Verhaftungen PI (4,5) P2 – Synthese. Zweitens kann es nach Klasse phosphoryliert und verbraucht werden , ich PI3K – Kinasen (PI3K) und in PI (3,4,5) P 3 12 umgewandelt. Eine Rolle für Phosphatasen und Phospholipasen hat auch in PI (4,5) P 2 Hydrolyse und F-Actin – Entfernung während der Phagozytose in Säugerzellen und in Dictyostelium 13,14 angedeutet worden. Die Phospholipase C (PLC) δ hydrolisiert PI (4,5) P 2 in Diacylglycerin und Inositol-1,4,5- Tris – Phosphat. Die PI (4,5) P2 und PI (3,4,5) P 3 Phosphatase OCRL (Lowe-Syndrom Lowe) wurde ebenfalls in phagosome Bildung in Verbindung gebracht. Präzise lokale Bildung von F-Actin und seine Depolymerisation fest in Raum und Zeit geregelt wird, und wir haben gezeigt, dass die Rekrutierung von intrazellulären Kompartimenten gezeigt ist wichtig, lokal die OCRL Phosphatase zu liefern, was zu einer lokalen Aktin Depolymerisation an der Basis des phagozytischen Tasse beitragen <sup> 13,15. Dazu verwendeten wir die Versuchsanordnung hier beschrieben.
Der Mechanismus und die molekularen Spieler für phagosome Schließung und Membran scission erforderlich bleiben schlecht wegen der Schwierigkeiten, definiert bei der Visualisierung und Überwachung der Website von phagosome Schließung. Bis vor kurzem wurde die Phagozytose auf festen oder lebenden Zellen beobachtet, die Teilchen auf ihrer Rückenfläche internalisieren oder auf ihren Seiten, so dass die rechtzeitige Visualisierung des Standortes von phagosome Schließung schwierig. Darüber hinaus Befestigungsmethoden könnten Rückzug von Membranen und Vorspannung bewirken, dass die Ergebnisse auf Pseudopodien Erweiterung und Schließung. Dagegen ist der Test, den wir eingerichtet haben und beschreiben hier können wir pseudopod Erweiterung und die Schließung Schritt der Phagozytose in lebenden Zellen 13, bezogen auf die gesamte interne Reflexion Mikroskopie (TIRFM) 16 sichtbar zu machen. Diese optische Technik verwendet eine abklingende Welle Fluorophore in einem dünnen Bereich zwischen einer transparenten an der Grenzfläche anzuregen, soDeckel (Deckglas) und eine Flüssigkeit (Zellkulturmedium). Die Dicke der Anregungstiefe beträgt etwa 100 nm von der festen Oberfläche, so dass die Visualisierung von molekularen Ereignissen nahe an der Plasmamembran. TIRFM ermöglicht ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, und begrenzt die out-of-focus-Fluoreszenz und die Cytotoxizität aufgrund Beleuchtung der Zellen.
Ausnutzend TIRFM, entwickelten wir das "phagosome Verschluss assay" in dem Deckgläschen mit Poly-Lysin aktiviert werden und dann beschichtet mit IgG-opsonisiertes roten Blutzellen (IgG-SRBCs). Makrophagen transient fluoreszierend markierten Proteine von Interesse exprimieren, werden dann die IgG-SRBCs zu versenken erlaubt. Während Zellen, die die Zielpartikel lösen, die nicht-kovalent an die Glasoberfläche sind, können die Spitzen der Pseudopodien beobachtet und in den TIRF-Modus aufgezeichnet werden. TIRF Akquisitionen mit Akquisitionen im Epifluoreszenz-Modus kombiniert, nach der Stufe 3 um oben verlagert, was die vis erlaubtualization der Basis des phagozytischen Tasse. Zugabe von pharmakologischen Wirkstoffen wie diejenigen, Actin oder dynamin während des Prozesses Hemmen ist auch möglich, das Verfahren weiter auf molekularer Ebene zu sezieren.
Das Protokoll im Detail hier beschrieben ist, für eine RAW264.7 murine Makrophagenzelllinie und opsonierten Partikel, aber praktisch kann es auf andere phagozytische Zelle und mit anderen Zielen, wie beispielsweise Kügelchen angepasst werden. Diese Methode wird eine bessere Charakterisierung der Regelung in Zeit und Raum der molekularen Spieler in pseudopod Erweiterung und phagosome Schließung während verschiedener phagozytischen Prozessen beteiligt zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
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