"फेगोसोम बंद परख" तीन आयाम में फेगोसोम गठन कल्पना का प्रयोग कुल आंतरिक परावर्तन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Phagocytosis एक प्रमुख सेल समारोह में कहा कि मान्यता के साथ और रिसेप्टर्स की सतह के लिए है, जो तब internalization और किया जाता है सामग्री की गिरावट की ओर जाता है सामग्री के बंधन से शुरू होता है। ऐसे सांचे Dictyostelium discoideum और अमीबा के रूप में एक कोशिकीय eukaryotes बैक्टीरिया पर खिलाने के लिए phagocytosis का उपयोग करते हैं, उच्च जीवों पेशेवर कोशिकाओं के साथ विकसित किया है। मैक्रोफेज या वृक्ष के समान कोशिकाओं विभिन्न ऊतकों और अंगों में रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं, और प्रतिजन प्रस्तुति और साइटोकाइन उत्पादन 1-4 के माध्यम से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। कुछ परिस्थितियों में phagocytosis गैर पेशेवर phagocytic कोशिकाओं, जैसे, endothelial और उपकला कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रक्रिया के दौरान विकास और सामान्य ऊतक कारोबार और remodeling के लिए वयस्कता में homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसे वृषण या रेटिना में Sertoli कोशिकाओं के रूप में अंत में, विशेष फ़ैगोसाइटवर्णक उपकला कोशिकाओं अत्यंत शक्तिशाली फ़ैगोसाइट 5 हैं।
एक फेगोसोम के गठन जहां सूक्ष्मजीवों या सेलुलर मलबे की गिरावट phagocytic सेल की सतह पर phagocytic रिसेप्टर्स की क्लस्टरिंग के साथ शुरू होता है होता है। बहाव के संकेत ऐसे एफसी रिसेप्टर्स (एफसीआर) या पूरक रिसेप्टर्स (सीआरएस) के रूप में निम्नलिखित opsonic रिसेप्टर्स की क्लस्टरिंग घटनाओं में अच्छी तरह से विशेषता किया गया है। हालांकि, वहाँ भी टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), lectins, mannose रिसेप्टर्स और मेहतर रिसेप्टर्स सहित कई गैर opsonic रिसेप्टर्स हैं। इन रिसेप्टर्स ऐसे mannose या fucose के अवशेष, phosphatidylserine, और lipopolysaccharides 1,6-9 के रूप में कण सतह पर निर्धारकों को पहचानते हैं।
पैथोजन या सेल मलबे मान्यता के लिए और phagocytic रिसेप्टर के कई प्रकार है, जो तब तीव्र और क्षणिक actin remodeling के लिए नेतृत्व की क्लस्टरिंग बाध्यकारी शामिल है। intracellular compartmen के समानांतर, फोकल exocytosis मेंटीएस झिल्ली तनाव की रिहाई के लिए योगदान देता है और बड़े कणों के कुशल phagocytosis के लिए महत्वपूर्ण है। actin polymerization और झिल्ली विरूपण करने के लिए अग्रणी संकेत घटनाओं प्रयोगात्मक मॉडल है कि एक भी phagocytic रिसेप्टर ट्रिगर में विच्छेदित कर रहे थे। एफसीआर की मध्यस्थता phagocytosis के दौरान, वहाँ तीव्र actin polymerization कि छोटे GTPases (आरएसी, Cdc42) द्वारा विनियमित किया जाता है। उनकी डाउनस्ट्रीम प्रभावोत्पादक के बीच, Wiskott-एल्ड्रिच सिंड्रोम प्रोटीन (ततैया) एक्टिन से संबंधित प्रोटीन 2/3 परिसर (Arp2 / 3) कि एक्टिन तंतु 1,2,4,10 nucleates की सक्रियता के लिए होता है। Phosphatidylinositol-4, 5-बाइफोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2) के स्थानीय उत्पादन प्रारंभिक actin polymerization कि pseudopod गठन ड्राइव के लिए महत्वपूर्ण है। गड़बड़ी (3,4,5) पी 3 इसका रूपांतरण pseudopod विस्तार और फेगोसोम बंद 11 के लिए आवश्यक है। कई रास्ते के पीआई (4,5) पी 2 लापता होने के लिए योगदान करते हैं। phosphatidylinositol फॉस्फेट चीन के सबसे पहले टुकड़ीसत्र फेगोसोम गिरफ्तारी पीआई (4,5) पी 2 संश्लेषण से (PIPKIs)। दूसरे, यह phosphorylated और वर्ग से भस्म मैं kinases (PI3K) PI3K और पीआई (3,4,5) पी 3 से 12 परिवर्तित किया जा सकता है। फास्फेटेजों और phospholipases के लिए एक भूमिका भी स्तनधारी कोशिकाओं में और Dictyostelium 13,14 में phagocytosis दौरान पीआई (4,5) पी 2 hydrolysis और एफ actin हटाने में निहित कर दिया गया है। Phospholipase सी (पीएलसी) δ diacylglycerol और inositol-1,4,5- Tris फॉस्फेट में hydrolyzes पीआई (4,5) पी 2। पीआई (4,5) पी 2 और पीआई (3,4,5) पी 3 फॉस्फेट OCRL (लोव की oculocerebrorenal सिंड्रोम) भी फेगोसोम गठन में फंसाया गया है। एफ actin और उसके depolymerization की सटीक स्थानीय गठन कसकर स्थान और समय में नियंत्रित किया जाता है और हम intracellular डिब्बों की है कि भर्ती से पता चला है स्थानीय स्तर पर OCRL फॉस्फेट देने के लिए, इस प्रकार phagocytic कप के आधार पर स्थानीय actin depolymerization के लिए योगदान महत्वपूर्ण है <sup> 13,15। इस के लिए, हम प्रयोगात्मक सेट अप यहाँ वर्णित किया करते थे।
तंत्र और आणविक फेगोसोम बंद करने और झिल्ली तराश के लिए आवश्यक खिलाड़ियों खराब क्योंकि visualizing और फेगोसोम बंद होने के साइट की निगरानी करने में कठिनाइयों का परिभाषित रहते हैं। अभी हाल तक, phagocytosis निश्चित या जीवित कोशिकाओं है कि उनके पृष्ठीय चेहरे पर या अपने पक्ष पर कणों internalize पर मनाया गया, फेगोसोम बंद मुश्किल की साइट के समय पर दृश्य बना रही है। इसके अलावा, फिक्सिंग के तरीकों झिल्ली और पूर्वाग्रह pseudopodia विस्तार और बंद करने पर परिणाम के त्याग का कारण बन सकता है। इसके विपरीत, परख है कि हम स्थापित किया है और यहाँ का वर्णन है हमें pseudopod विस्तार और जीवित कोशिकाओं में 13 phagocytosis को बंद करने के कदम, कुल आंतरिक प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (TIRFM) 16 के आधार पर कल्पना करने के लिए अनुमति देता है। इस ऑप्टिकल तकनीक के लिए एक पारदर्शी बीच इंटरफेस में एक पतली क्षेत्र में fluorophores उत्तेजित करने के लिए एक क्षणभंगुर लहर उपयोग करता है तोढक्कन (coverslip) और एक तरल (सेल संस्कृति के माध्यम से)। उत्तेजना गहराई की मोटाई प्लाज्मा झिल्ली के करीब आणविक घटनाओं के दृश्य की अनुमति, ठोस सतह से करीब 100 समुद्री मील दूर है। TIRFM एक उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात की अनुमति देता है, और कोशिकाओं की रोशनी के कारण एकत्र बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति और cytotoxicity सीमा।
TIRFM का लाभ उठाते हुए, हम "फेगोसोम बंद परख" जिसमें coverslips पाली lysine के साथ सक्रिय कर रहे हैं और उसके बाद आईजीजी opsonized लाल रक्त कोशिकाओं (आईजीजी SRBCs) के साथ लेपित विकसित की है। ब्याज की क्षणिक fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त मैक्रोफेज तो आईजीजी SRBCs निमग की अनुमति दी जाती है। कोशिकाओं को लक्षित कणों कि कांच की सतह लिए बाध्य कर रहे गैर covalently को अलग करते हैं, pseudopods के सुझावों मनाया और TIRF मोड में दर्ज किया जा सकता है। TIRF अधिग्रहण epifluorescence मोड में अधिग्रहण के साथ संयुक्त कर रहे हैं ऊपर चरण 3 माइक्रोन स्थानांतरण, जो तुलना की अनुमति देता है के बादphagocytic कप के आधार की ualization। इस तरह की प्रक्रिया के दौरान बाधा actin या dynamin उन के रूप में औषधीय दवाओं के अलावा आगे आणविक स्तर पर प्रक्रिया टुकड़े करना भी संभव है।
प्रोटोकॉल यहाँ विस्तार में वर्णित एक RAW264.7 murine बृहतभक्षककोशिका सेल लाइन और opsonized कणों के लिए है, लेकिन वास्तव में, यह किसी भी अन्य phagocytic सेल करने के लिए और इस तरह के मोती के रूप में अन्य लक्ष्यों के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। इस विधि समय और आणविक विभिन्न phagocytic प्रक्रिया के दौरान pseudopod विस्तार और फेगोसोम बंद में शामिल खिलाड़ियों के अंतरिक्ष में विनियमन के बेहतर लक्षण वर्णन की अनुमति देगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
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