Evaluación rápida y específica de la peroxidasa Actividad de halogenación en muestras de sangre enriquecida en leucocitos
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
En este trabajo se describe un protocolo para el enriquecimiento rápido y estandarizado de los leucocitos de pequeñas muestras de sangre entera. Este procedimiento se basa en la lisis hipotónica de los eritrocitos y se puede aplicar a las muestras de humanos, así como a la sangre de origen no humano. El pequeño volumen de muestra inicial de alrededor de 50 a 100 l hace que este método es aplicable a muestras de sangre recurrente de pequeños animales de laboratorio. Por otra parte, el enriquecimiento de leucocitos se logra en cuestión de minutos y con esfuerzos materiales bajos en relación con los productos químicos y la instrumentación, por lo que este método aplicable en múltiples entornos de laboratorio.
Purificación estandarizada de los leucocitos se combina con un método altamente selectivo tinción para evaluar la actividad peroxidasa de halogenación de las peroxidasas heme, la mieloperoxidasa (MPO) y la peroxidasa de eosinófilos (EPO), es decir, la formación de hipocloroso y ácido hipobromoso (HOCl y HOBr). Mientras MPO se expresa fuertemente en neutrophils, el tipo de célula inmune más abundante en la sangre humana, así como en los monocitos, la enzima relacionada EPO se expresa exclusivamente en los eosinófilos. La actividad de halogenación de estas enzimas se aborda mediante la fluoresceína casi HOCl- y HOBr específica colorante aminofenil (APF) y el peróxido de hidrógeno sustrato de peroxidasa primaria. Tras el análisis de citometría de flujo subsiguiente todas las células peroxidasa positiva (neutrófilos, monocitos, eosinófilos) son distinguibles y su actividad peroxidasa de halogenación pueden ser cuantificados. Desde tinción APF se puede combinar con la aplicación de marcadores de superficie celular, este protocolo se puede extender para tratar específicamente de leucocitos subfracciones. El método es aplicable para detectar la producción de HOCl y HOBr tanto en humanos y en los leucocitos de roedores.
Dado el papel inmunológica ampliamente y diversamente discutido de estos productos enzimáticos en enfermedades inflamatorias crónicas, este protocolo puede contribuir a una mejor comprensión de larelevancia inmunológica de peroxidasas heme derivadas de leucocitos.
Introduction
Los leucocitos polimorfonucleares (PMNs, también llamados granulocitos) y los monocitos representan importantes componentes celulares del sistema inmune innato en el 1,2 sangre. Contribuyen a la principal defensa contra los patógenos, así como a la activación del sistema inmune adquirido y la iniciación de una respuesta inflamatoria sistémica 2-4. Sin embargo, especialmente neutrófilos, el tipo más abundante de los granulocitos y monocitos también contribuyen significativamente a la regulación y la terminación de los eventos inflamatorios agudos 5. Por lo tanto estas células también pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide 6,7. De hecho, el asma, una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias, se caracteriza por una apoptosis alterada de eosinófilos, el segundo tipo más de granulocitos en la sangre 8. Sin embargo, la apoptosis de los granulocitos y su rápida eliminación por macrófagos son dos pasos esenciales durante la terminación celularde la inflamación 9-11.
En las células inmunes con nombre dos enzimas estrechamente relacionadas, a saber, mieloperoxidasa (MPO, neutrófilos y monocitos) y eosinófilos peroxidasa (EPO, eosinófilos) se puede encontrar 12,13. Estos peroxidasas hemo están clásicamente relacionadas con la respuesta inmune humoral como se oxidan de dos electrónicamente (pseudo-) haluros a la hipo correspondiente (pseudo) ácidos halosos que son conocidos por sus propiedades bactericidas 14-16. En condiciones fisiológicas MPO principalmente forma ácido hipocloroso (HOCl) y hipotiocianito (- OSCN) mientras que el segundo y hipobromoso ácido (HOBr) están formados por EPO 17-19. Los nuevos resultados sugieren que este (pseudo-) la actividad enzimática de halogenación también puede contribuir a la regulación de las respuestas inflamatorias y para la terminación de las reacciones inmunes 20,21. De hecho, la producción de HOCl mediante MPO y los productos derivados, se mostró a suprimir T respuestas inmunitarias adaptativas basadas en células 22-24.
Con el fin de ganar más conocimientos sobre la función inmunológica de los leucocitos del sistema inmune innato en enfermedades inflamatorias crónicas y para determinar la contribución de MPO y EPO a esta función fisiológica, hemos desarrollado un método para enriquecer rápidamente leucocitos de pequeñas muestras de sangre para un posterior específica determinación de la actividad de halogenación peroxidasa en estas células. Para el agotamiento de eritrocitos hemos elegido un método estandarizado incluyendo dos posteriores etapas de lisis hipotónica con agua destilada, lo que conduce a un enriquecimiento de leucocitos rápida a bajas costes de material. Para la determinación posterior de la MPO de halogenación y actividad de la EPO se utilizó el colorante fluoresceína aminofenil HOCl- y HOBr-específica (APF) 25-27. En contraste con la aplicación de métodos de tinción de peroxidasa no específica 28,29, este enfoque permite la detección selectiva de la actividad de halogenación peroxidasa, que a menudo se deteriora en infl severainflamación 30,31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana el aislamiento de células peroxidasa positiva a menudo sólo se centra en estas células e incluye una separación de los neutrófilos de otros leucocitos por centrifugación en gradiente de densidad 38. Sin embargo, como los neutrófilos son mucho menos abundantes en las muestras de sangre murinos 39 para los últimos métodos más complicados tienen que utilizarse 40. Además ambos métodos también conducen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
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