백혈구가 풍부한 혈액 샘플의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 신속하고 구체적인 평가
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
이 논문에서는 작은 전체 혈액 샘플에서 백혈구의 신속하고 표준화 된 농축을위한 프로토콜을 설명한다. 이 절차는 적혈구의 저 삼투압의 용해를 기반으로 비 – 인간 기원의 혈액뿐만 아니라 인간의 샘플에 적용될 수있다. 약 50 ~ 100 μL의 작은 초기 샘플 볼륨이 작은 실험 동물에서 반복 채혈에이 방법을 적용 할 수 있습니다. 또한, 백혈구 농축 여러 실험실 환경에서이 방법을 적용하고, 분 이내에 화학 물질 및 계측에 대한 낮은 재료 노력으로 얻을 수있다.
백혈구의 표준화 정제는 매우 선택적 헴 퍼 옥시다아제의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성을 평가하기 염색법, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO), 즉, 차아 및 하이포 아 브롬 산 (의 HOCl 및 HOBr)의 형성과 결합된다. MPO 강하게 neut 표현되지만rophils 인간 혈액과 단핵 세포에 가장 풍부한 면역 세포 유형은 관련 효소 EPO 독점적 호산구 표현된다. 이러한 효소의 활성은 할로겐화 거의 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF) 및 차 퍼 옥시 다제 기질, 과산화수소를 사용하여 해결된다. 이후의 유세포 분석되면 모든 퍼 옥시 다제 양성 세포 (호중구, 단핵구, 호산구)를 구별하고 그들의 할로겐화 퍼 옥시다아제 활성을 정량화 할 수있다. APF 염색은 세포 표면 마커의 적용과 결합 될 수 있기 때문에,이 프로토콜은 특히 백혈구 하위 분획을 해결하기 위해 확장 될 수있다. 상기 방법은 인간 및 쥐 백혈구에 양의 HOCl 및 HOBr 생산 검출에 적용 할 수있다.
만성 염증성 질환에서 이러한 효소 제품의 광범위하고 다양하게 설명 면역 역할을 감안할 때, 이러한 프로토콜의 이해에 기여백혈구 파생 된 헴의 퍼 옥시다아제의 면역 학적 관련성.
Introduction
다형 핵 백혈구 (백혈구라고도 과립구) 및 단핵구는 혈액 -1,2-의 선천 면역 세포의 중요한 구성 요소를 나타낸다. 이들은 병원균뿐만 아니라, 획득 면역 시스템의 활성화 및 전신성 염증 반응 2-4 개시까지 기본 방위에 기여한다. 그러나, 특히 호중구 과립구의 가장 풍부한 형태 및 단핵구는 크게 급성 염증성 사건 (5)의 규제와 종단에 기여한다. 따라서,이 세포는 류마티스 관절염 -6,7- 같은 만성 염증성 질환에서 중요한 역할을 할 수있다. 사실, 천식, 만성 염증성기도 질환, 호산구의 세포 사멸을 손상 혈액 여덟 번째 대부분 과립구 형 특징이다. 그러나 과립구의 세포 사멸 및 대 식세포에 의해 자신의 빠른 제거는 휴대 종료하는 동안 두 가지 중요한 단계는염증 9-11의.
명명 된 면역 세포 두 밀접하게 관련 효소, 즉 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO, 호중구와 단핵구)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO, 호산구)에서 12, 13에서 찾을 수 있습니다. 이 헴 퍼 옥시다아제는 고전 그들이 두 전자적으로 해당 저자 (의사) 내지 (의사 -) 할로겐 자신의 살균 특성 14-16 알려져있다 halous 산을 산화로 체액 성 면역 반응 관련이 있습니다. 생리 학적 조건 MPO 주로 양식 차아 염소산 (의 HOCl)과 hypothiocyanite (- OSCN) 후자와 하이포 아 브롬 산 (HOBr)이 EPO 17-19로 형성되어있다. 새로운 결과는이 (의사 -) 할로겐 효소 활성은 또한 염증 반응의 조절과 면역 반응 (20, 21)의 종료에 기여할 수 있음을 시사한다. 사실, MPO 및 가공 제품의 HOCl 의해 생산 T 세포 기반 적응 면역 반응을 억제 22-2 나타났다4.
이 생리적 기능 MPO와 EPO의 기여를 만성 염증성 질환의 선천 면역에서 백혈구의 면역 학적 역할에 대한 추가 통찰력을 얻을 수를 결정하기 위해 우리는 빨리 후속 특정 소형 혈액으로부터 백혈구를 농축하는 방법을 개발 이들 세포의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성의 결정. 적혈구 고갈 위해 우리는 낮은 재료 비용으로 빠른 백혈구 농축에 이르게 증류수, 두-이후 저장성 용해 단계를 포함하는 표준화 된 방법을 선택했습니다. 후속 할로겐 MPO의 결정 및 EPO의 활동에 대한 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF)는 25 ~ 27을 사용 하였다. 퍼 옥시다아제 비특이적 염색 방법 28,29 적용 달리,이 방법은 종종 심각한 손상 infl에 할로겐 옥시다아제 활성의 선택적 검출을 허용ammation 30, 31.
Protocol
Representative Results
Discussion
호중구를 인간 혈액에서 가장 풍부한 백혈구과 마찬가지로 퍼 옥시 다제 양성 세포의 분리는 종종 이러한 셀에 초점을 밀도 구배 원심 분리 (38)에 의해 다른 백혈구에서 호중구의 분리를 포함한다. 호중구는 훨씬 덜 풍부 뮤린 혈액 샘플에 대해서는 아직 후자보다 복잡한 방법 39 40을 사용한다. 또한 두 방법 모두는 또한 더 큰 혈액 볼륨의 필요성, 샘플에서 퍼 옥시 다제 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
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