Avaliação rápida e específica da atividade da peroxidase de halogenação em amostras de sangue enriquecido por leucócitos
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
Neste trabalho é descrito um protocolo para o enriquecimento rápido e padronizado de leucócitos a partir de amostras de sangue total pequenos. Este procedimento baseia-se na lise hipotónica de eritrócitos e pode ser aplicado a amostras humanas, bem como com o sangue de origem não-humana. O pequeno volume da amostra inicial de cerca de 50 a 100 ul torna este método aplicável para a amostragem de sangue de repetição a partir de pequenos animais de laboratório. Além disso, o enriquecimento de leucócitos é alcançado em poucos minutos e com os esforços de baixo materiais entre os produtos químicos e de instrumentação, tornando este método aplicável em vários ambientes de laboratório.
Purificação de leucócitos Padronizada é combinado com um método altamente selectivo coloração para avaliar a actividade da peroxidase de halogenação das peroxidases heme, mieloperoxidase (MPO) e peroxidase de eosinófilo (EPO), ou seja, a formação de ácido hipocloroso e hipobromoso (HOCl e HOBr). Enquanto MPO é fortemente expressa em neutrophils, o tipo de célula mais abundante imunitário no sangue humano, assim como em monócitos, a enzima relacionada com a EPO é expresso exclusivamente em eosinófilos. A atividade de halogenação destas enzimas são os destinatários usando a fluoresceína específica HOBr-quase HOCl- e corante aminofenil (APF) e da peroxidase primário de peróxido de hidrogênio substrato. Após a análise de citometria de fluxo subsequente todas as células peroxidase-positivo (neutrófilos, monócitos, eosinófilos) são distinguíveis e a sua actividade de peroxidase de halogenação pode ser quantificada. Uma vez que a coloração APF pode ser combinado com a aplicação de marcadores de superfície celular, este protocolo pode ser estendido para abordar especificamente sub-fracções de leucócitos. O método é aplicável para a detecção de HOCl e HOBr produção tanto em humano e em leucócitos de roedores.
Dado o papel imunológico amplamente discutido e diversamente destes produtos enzimáticos em doenças inflamatórias crónicas, este protocolo pode contribuir para uma melhor compreensão dorelevância imunológica de peroxidases heme derivados de leucócitos.
Introduction
Leucócitos polimorfonucleares (PMN, também denominados granulócitos e monócitos) representam importantes componentes celulares do sistema imune inato no sangue 1,2. Eles contribuem para a defesa principal contra patogénios, assim como para a activação do sistema imune adaptativo e o início de uma resposta inflamatória sistémica 2-4. No entanto, especialmente dos neutrófilos, o tipo mais abundante de granulócitos e monócitos também contribuem significativamente para a regulação e rescisão de eventos inflamatórios agudos 5. Por conseguinte, estas células podem também desempenhar um papel importante em doenças inflamatórias crónicas como a artrite reumatóide 6,7. Na verdade, a asma, uma doença inflamatória crónica das vias aéreas, é caracterizada por uma apoptose dos eosinófilos auditivos, o segundo tipo mais de granulócitos no sangue 8. No entanto, a apoptose de granulócitos e sua rápida remoção por macrófagos são dois passos essenciais durante a terminação celularde inflamação 9-11.
Nas células imunes chamados duas enzimas intimamente relacionados, nomeadamente mieloperoxidase (MPO, neutrófilos e monócitos) e peroxidase de eosinófilo (EPO, eosinófilos) pode ser encontrado 12,13. Estas peroxidases heme são classicamente relacionada com a resposta imune humoral como eles de duas electronicamente oxidar halogenetos de (pseudo) para o hipo correspondente (pseudo) halous ácidos que são conhecidos pelas suas propriedades bactericidas 14-16. Sob condições fisiológicas MPO se forma principalmente o ácido hipocloroso (HOCl) e hypothiocyanite (- OSCN) enquanto que o ácido hipobromoso e último (HOBr) são formados por EPO 17-19. Novos resultados sugerem que esta atividade da enzima de halogenação (pseudo-) também podem contribuir para a regulação de respostas inflamatórias e ao encerramento de reações imunes 20,21. De facto, a produção de HOCl por MPO e produtos derivados foram mostrados para suprimir respostas adaptativas baseados em células imunitárias T 22-24.
A fim de obter mais insights sobre o papel imunológico de leucócitos a partir do sistema imune inato em doenças inflamatórias crónicas e para determinar a contribuição de MPO e EPO a esta função fisiológica foi desenvolvido um método para enriquecer rapidamente leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue para uma específica subsequente determinação da atividade da peroxidase de halogenação nestas células. Para a depleção de eritrócitos nós escolhemos um método padronizado incluindo as etapas de lise hipotônica de dois subsequentes com água destilada, o que leva a um enriquecimento de leucócitos rápido em custos de material baixos. Para a determinação subsequente da MPO halogenação e da actividade EPO a HOCl- e específicos de HOBr corante aminofenil fluoresceína (APF) foi usado 25-27. Em contraste com a aplicação de métodos de coloração de peroxidase inespecífica 28,29, esta abordagem permite a detecção selectiva da actividade de peroxidase de halogenação, o qual é muitas vezes prejudicada pelo infl graveamação 30,31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue humano, o isolamento de células de peroxidase-positivos muitas vezes só incide sobre estas células e inclui uma separação dos neutrófilos a partir de outros leucócitos por centrifugação em gradiente de densidade de 38. No entanto, como os neutrófilos são muito menos abundante em amostras de sangue de murino 39 para os últimos métodos mais complicadas tem que ser utilizado 40. Além disso ambos os métodos tam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
References
- Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
- Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
- Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
- Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
- Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
- Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
- Loughran, N. B., O’Connor, B., O’Fagain, C., O’Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
- Zámocký, M., Obinger, C., Torres, E., Ayala, E. M. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. , 7-35 (2010).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
- Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
- Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
- Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
- van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
- Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
- Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
- Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
- Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
- Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
- Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
- Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
- Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
- Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
- Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
- Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
- Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
- Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
- Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
- Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
- Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
- Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
- Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
- Hu, Y., Ashman, R. B. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. , 101-113 (2012).
- Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
- Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils’ oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
- Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
- Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
- Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
- Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
- Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
- Sun, Z. -. N., Liu, F. -. Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
- Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).
