تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
في هذه الورقة يوصف بروتوكول لإثراء سريع وموحد من الكريات البيض من عينات الدم كلها صغيرة. ويستند هذا الإجراء على تحلل منخفض التوتر من كريات الدم الحمراء ويمكن تطبيقها على عينات الإنسان، وكذلك للدم من مصدر غير إنساني. حجم العينة الأولي صغيرة من حوالي 50 إلى 100 ميكرولتر يجعل هذه الطريقة تنطبق على اخذ عينات من الدم المتكررة من حيوانات المختبر الصغيرة. وعلاوة على ذلك، ويتحقق تخصيب الكريات البيض في غضون دقائق ومع الجهود المواد منخفضة المتعلقة بالمواد الكيميائية والأجهزة، مما يجعل هذه الطريقة قابلة للتطبيق في بيئات المختبرات متعددة.
يتم الجمع بين تنقية موحدة من الكريات البيض مع طريقة انتقائية للغاية تلطيخ لتقييم النشاط البيروكسيديز halogenating من مستخلصات الهيم، الميلوبيروكسيديز (MPO) والبيروكسيديز الحمضات (EPO)، أي تشكيل من تحت الكلور وحمض hypobromous (HOCL وHOBr). في حين أن الخطة الرئيسية للعمليات أعرب بقوة في neut غيرrophils، والأكثر وفرة المناعي نوع من الخلايا في الدم البشري وكذلك في وحيدات، وأعرب عن انزيم ذات الصلة EPO حصرا في الحمضات. وتعالج النشاط halogenating هذه الانزيمات باستخدام فلوريسئين تقريبا HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl (APF) والبيروكسيديز الأساسي بيروكسيد الهيدروجين الركيزة. على تحليل التدفق الخلوي لاحق كل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي (العدلات، وحيدات، الحمضات) يمكن تمييزها، ويمكن كميا نشاطهم البيروكسيديز halogenating. منذ APF تلطيخ يمكن الجمع بين تطبيق علامات سطح الخلية، وهذا البروتوكول يمكن أن تمتد إلى معالجة على وجه التحديد الكريات البيض كسور الفرعية. هذه الطريقة تنطبق على كشف HOCL وHOBr إنتاج في كل من الإنسان وفي الكريات البيض القوارض.
ونظرا للدور المناعية التي نوقشت على نطاق واسع وبتنوع هذه المنتجات الأنزيمية في الأمراض الالتهابية المزمنة، قد يسهم هذا البروتوكول إلى فهم أفضل للأهمية المناعية من مستخلصات الهيم المشتقة من خلايا الدم البيضاء.
Introduction
الكريات البيض النوى (PMNs، وتسمى أيضا المحببة) وحيدات تمثل المكونات الخلوية الهامة من نظام المناعة الفطري في 1،2 الدم. لأنها تسهم في الدفاع الأول ضد الجراثيم وكذلك لتفعيل نظام المناعة المكتسبة والشروع في الاستجابة الالتهابية الجهازية 2-4. بعد خصوصا العدلات، النوع الأكثر وفرة من المحببة، وحيدات أيضا تسهم إلى حد كبير في التنظيم وإنهاء أحداث الالتهابية الحادة 5. لذلك قد تكون هذه الخلايا أيضا أن تلعب دورا هاما في الأمراض الالتهابية المزمنة مثل التهاب المفاصل الروماتويدي 6،7. في الواقع، والربو، ومرض مجرى الهواء التهابي مزمن، وتتميز الخلايا ضعاف الحمضات، والنوع الثاني الأكثر محببة في الدم 8. إلا أن موت الخلايا المبرمج للالمحببة وإزالة سريعة من قبل الضامة هما خطوتان أساسيتان أثناء إنهاء الخلويالتهاب 9-11.
في الخلايا المناعية المسماة اثنين من الانزيمات وترتبط ارتباطا وثيقا، وهي الميلوبيروكسيديز (الخطة الرئيسية للعمليات، العدلات وحيدات) والحمضية البيروكسيديز (EPO، الحمضات) ويمكن الاطلاع 12،13. وهذه بيروكسيديزات الهيم المرتبطة تقليديا إلى الاستجابة المناعية الخلطية لأنها يومين إلكترونيا أكسدة (الزائفة) هاليدات للفراش لا تسبب المقابلة (الزائفة) الأحماض halous التي هي معروفة لخصائص جراثيم من 14-16. في ظل الظروف الفسيولوجية MPO أساسا أشكال حمض تحت الكلور (HOCL) وhypothiocyanite (- OSCN)، في حين تتشكل حمض الأخير وhypobromous (HOBr) من خلال المكتب الأوروبي للبراءات 17-19. وتشير النتائج الجديدة أن هذا (الزائفة) نشاط انزيم halogenating قد تسهم أيضا في تنظيم الاستجابات الالتهابية وإنهاء التفاعلات المناعية 20،21. في الواقع، عرضت على إنتاج HOCL من الخطة الرئيسية للعمليات والمنتجات المشتقة منها لقمع تي خلية القاعدة الاستجابات المناعية التكيفية 22-24.
من أجل كسب المزيد من الضوء على دور مناعي من الكريات البيض من نظام المناعة الفطري في الأمراض الالتهابية المزمنة وتحديد مساهمة الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات لهذه الوظيفة الفسيولوجية قمنا بتطوير طريقة لإثراء بسرعة الكريات البيض من عينات دم صغيرة لأغراض محددة لاحق تقرير النشاط halogenating البيروكسيديز في هذه الخلايا. لاستنزاف كرات الدم الحمراء اخترنا طريقة موحدة بما في ذلك الخطوات تحلل ناقص التوتر اللاحقة مع اثنين من الماء المقطر، الأمر الذي يؤدي إلى تخصيب الكريات البيض سريع في تكاليف المواد منخفضة. لقرار لاحق من الخطة الرئيسية للعمليات halogenating والنشاط EPO تم استخدام HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl فلوريسئين (APF) 25-27. وعلى النقيض من تطبيق أساليب تلطيخ البيروكسيديز غير محددة 28،29، وهذا النهج يسمح للكشف انتقائي من النشاط halogenating البيروكسيديز، والتي غالبا ما تضعف في infl شديدammation 30،31.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم البشري عزل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي يركز كثير من الأحيان إلا على هذه الخلايا ويتضمن الفصل العدلات من الكريات البيض الأخرى عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي 38. ولكن كما العدلات أقل وفرة في عينات دم الفئر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
References
- Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
- Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
- Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
- Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
- Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
- Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
- Loughran, N. B., O’Connor, B., O’Fagain, C., O’Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
- Zámocký, M., Obinger, C., Torres, E., Ayala, E. M. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. , 7-35 (2010).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
- Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
- Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
- Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
- van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
- Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
- Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
- Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
- Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
- Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
- Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
- Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
- Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
- Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
- Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
- Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
- Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
- Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
- Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
- Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
- Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
- Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
- Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
- Hu, Y., Ashman, R. B. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. , 101-113 (2012).
- Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
- Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils’ oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
- Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
- Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
- Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
- Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
- Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
- Sun, Z. -. N., Liu, F. -. Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
- Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).
