Snabb och särskild bedömning av halogene peroxidasaktiviteten i Leukocyte berikad blodprover
Summary
This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.
Abstract
I detta dokument ett protokoll för snabb och standardiserad anrikning av leukocyter från små helblodsprover beskrivs. Detta förfarande är baserat på hypoton lys av erytrocyter och kan appliceras på humana prover såväl som till blod av icke-humant ursprung. Den lilla initiala provvolym på omkring 50 till 100 | j, l gör denna metod tillämpas på återkommande blodprov från små försöksdjur. Dessutom är leukocyter anrikning uppnås inom några minuter och med låga materialinsatser om kemikalier och instrumentering, vilket gör denna metod som är tillämplig i flera laboratoriemiljöer.
Standardiserad rening av leukocyter är kombinerat med ett mycket selektivt färgningsmetod för att utvärdera halogenerande peroxidasaktivitet av heme peroxidaser, myeloperoxidas (MPO) och eosinofilperoxidas (EPO), det vill säga, bildandet av underklor och underbromsyrlighet (HOCl och HOBr). Medan MPO uttrycks starkt i Neutrophils, den vanligast förekommande immuncelltypen i humant blod och i monocyter, den relaterade enzym EPO uteslutande uttrycks i eosinofiler. Halogeneringsaktivitet av dessa enzymer är beaktas med den nästan HOCl- och HOBr-specifika färgämnet aminofenyl fluorescein (APF) och den primära peroxidassubstrat väteperoxid. Vid efterföljande flödescytometrianalys alla peroxidas-positiva celler (neutrofiler, monocyter, eosinofiler) kan särskiljas och deras halogene peroxidasaktivitet kan kvantifieras. Sedan APF färgning kan kombineras med tillämpningen av cellytemarkörer, kan detta protokoll utökas till specifikt behandla leukocyter underfraktioner. Metoden kan användas för att upptäcka HOCl och HOBr produktion både i människa och gnagare leukocyter.
Tanke på det breda och mångsidigt diskuteras immunologisk roll dessa enzymatiska produkter i kroniska inflammatoriska sjukdomar, kan detta protokoll bidra till en bättre förståelse avimmunologisk relevans leukocyt-härledda heme peroxidaser.
Introduction
Polymorfonukleära leukocyter (PMN: er, även kallade granulocyter) och monocyter utgör viktiga cellulära komponenterna i det medfödda immunförsvaret i blodet 1,2. De bidrar till den primära försvaret mot patogener liksom till aktiveringen av det förvärvade immunsystemet och initiering av ett systemiskt inflammatoriskt svar 2-4. Ändå speciellt neutrofiler, den vanligast förekommande typen av granulocyter och monocyter också bidra avsevärt till regleringen och uppsägning av akuta inflammatoriska händelser 5. Därför dessa celler kan också spela en viktig roll vid kroniska inflammatoriska sjukdomar som reumatoid artrit 6,7. I själva verket, astma, en kronisk inflammatorisk luftvägssjukdom, kännetecknas av en försämrad apoptos av eosinofiler, den näst mest granulocyt typ i blodet 8. Ändå apoptos av granulocyter och deras snabba avlägsnande av makrofager är två viktiga steg under den cellulära uppsägningav inflammation 9-11.
I de nämnda immunceller två närbesläktade enzymer, nämligen myeloperoxidas (MPO, neutrofiler och monocyter) och eosinofilperoxidas (EPO, eosinofiler) kan hittas 12,13. Dessa heme peroxidaser är klassiskt relaterade till det humorala immunsvaret som de två elektroniskt oxidera (pseudo) halogenider till motsvarande insulinkänning (pseudo) halous syror som är kända för sina bakteriedödande egenskaper 14-16. Under fysiologiska betingelser MPO huvudsakligen bildar klorsyrlighet (HOCl) och hypothiocyanite (- OSCN) medan den senare och underbromsyrlighet (HOBr) bildas av EPO 17-19. Nya resultat tyder på att denna (pseudo-) halogeneenzymaktivitet också kan bidra till regleringen av inflammatoriska reaktioner och uppsägning av immunreaktioner 20,21. I själva verket var den HOCl produktion av MPO och trävaruprodukter visat sig undertrycka T-cell-baserade adaptiva immunsvar 22-24.
För att få mer insikt i den immunologiska rollen av leukocyter från det medfödda immunförsvaret vid kroniska inflammatoriska sjukdomar och för att bestämma bidraget från MPO och EPO till denna fysiologiska funktion har vi utvecklat en metod för att snabbt berika leukocyter från små blodprover för en efterföljande specifik bestämning av halogenerings peroxidasaktiviteten i dessa celler. För erytrocyt utarmning har vi valt en standardiserad metod inklusive två efterföljande hypotona lys steg med destillerat vatten, vilket leder till en snabb leukocyter anrikning vid låga materialkostnader. För den efterföljande bestämningen av halogene MPO och EPO aktivitet HOCl- och HOBr-specifika färgämnet aminofenyl fluorescein (APF) användes 25-27. I motsats till tillämpningen av ospecifika peroxidas färgningsmetoder 28,29, tillåter denna metod selektiv detektion av halogene peroxidasaktivitet, som ofta försämras vid svår inflammation 30,31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom neutrofiler är de mest förekommande leukocyter i blod isoleringen av peroxidas-positiva celler fokuserar ofta bara på dessa celler och innefattar en separation av neutrofiler från andra leukocyter genom densitetsgradientcentrifugering 38. Men när neutrofiler är mycket mindre rikligt förekommande i murina blodprov 39 för de senare mer komplicerade metoder måste användas 40. Dessutom också båda metoderna leder till avlägsnandet av peroxidas-positiva monocyter från pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the Sächsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).
Materials
| materials/equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | – |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | – |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g. 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100µl, 100-1000 µl an 500-5000µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | – |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | – |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450x g |
| Small centrifuge | eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5 % CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water | |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca(2+) | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquotes of e.g. 100 µl should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | – |
References
- Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
- Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
- Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
- Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
- Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
- Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
- Loughran, N. B., O’Connor, B., O’Fagain, C., O’Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
- Zámocký, M., Obinger, C., Torres, E., Ayala, E. M. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. , 7-35 (2010).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
- Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
- Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
- Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
- Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
- van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
- Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
- Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
- Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
- Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
- Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
- Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
- Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
- Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
- Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
- Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
- Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
- Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
- Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
- Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
- Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
- Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
- Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
- Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
- Hu, Y., Ashman, R. B. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. , 101-113 (2012).
- Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
- Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
- Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
- Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils’ oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
- Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
- Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
- Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
- Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
- Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
- Sun, Z. -. N., Liu, F. -. Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
- Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).
