Ploidiniveauet Manipulation af zebrafisk embryoner med Heat Shock 2 Behandling

Summary

En modificeret protokol for ploidi manipulation anvender en varmechok for at inducere en et-cyklus stall i cytokinese i det tidlige embryon. Denne protokol er påvist i zebrafisk, men kan gælde for andre arter.

Abstract

Manipulation af ploidi muliggør nyttige transformationer, såsom diploider til tetraploids eller haploider til diploider. I zebrafisk Danio rerio, specielt dannelsen af homozygote gynogenetic diploider er nyttig til genetisk analyse, fordi det tillader den direkte produktion af homozygoter fra en enkelt heterozygot mor. Denne artikel beskriver en modificeret protokol for ploidi dobbeltarbejde baseret på en varme puls under den første cellecyklus, Heat Shock 2 (HS2). Gennem inhibering af centriole overlapning, denne metode resulterer i et præcist celledeling stall under den anden cellecyklus. Den præcise én-cyklus division stall, koblet til upåvirket DNA dobbeltarbejde, resulterer i hele genomet dobbeltarbejde. Protokoller er forbundet med denne fremgangsmåde, indbefatter æg og sperm indsamling, UV-behandling af sædceller, in vitro-befrugtning og varme impuls til at forårsage en én-cellecyklus division forsinkelse og ploidi overlapning. En modificeret version af denne protokol kan anvendesat fremkalde ploidi ændringer i andre dyrearter.

Introduction

Denne protokol tillader manipulation af ploidi i zebrafisk embryoer, såsom i frembringelsen af homozygote gynogenetic diploider fra gynogenetic haploider (figur 1) eller produktionen af tetraploids. Dette opnås ved at inducere en forsinkelse i cytokinese svarende til netop en cellecyklus (figur 2A, 2B). Nøglen én-cyklus forsinkelse i cytokinese opnås ved behandling med varmeshock. Standardprotokollen af Heat Shock (HS) som oprindeligt beskrevet af Streisinger og kolleger involverede en temperatur puls i perioden 13-15 mpf, hvilket resulterer i en én-cyklus celledeling stall under den første cellecyklus ^1. Effektiviteten af ​​denne protokol er for nylig blevet forbedret ved at scanne de tidlige cellecyklus med en glidende tidsvindue af varme chokbehandling. Denne scanning identificeret et senere tidspunkt for et varmechok, stadig inden for den første celle cyklus (22-24 MPF), som resulterer i en højere brodeyos med en én-cyklus celledeling stall, som i dette tilfælde påvirker den anden cellecyklus ^2. Den iagttagelse, at eksperimentelle manipulationer i den første cellecyklus forstyrre celledeling under den anden cellecyklus og forårsage DNA-indholdet overlapning er også blevet rapporteret i andre fiskearter ^3,4. Vi henviser til denne modificerede protokol som Heat Shock 2 (HS2 – udtrykket "2" afspejler, at varmepulsen sker på et senere tidspunkt end standard HS metode, og at cellecyklus forsinkelse forårsaget af HS2 forekommer under den anden cellecyklus ). Disse undersøgelser viste, at grundlaget for cytokinese arrest efter varmechok er inhiberingen af ​​centriole overlapning under varmen puls, som påvirker spindeldannelse og fure induktion i følgende cellecyklus. HS2 resulterer i udbytter af cellecyklusstop nærmer 100%, og satser ploidi dobbeltarbejde op til 4 gange højere end standard HS ^2.

Embryoner behandlet witha varmechok under blastomer cellecyklus udviser mange skadelige virkninger, tyder på, at varmechok påvirker flere processer, der kræves for celledeling ^2. På den anden side, hvis varmen chok påføres forud for indledningen af cellecyklus (tidsperiode 0-30 MPF), det ser ud til at have virkninger i overensstemmelse med specifikke indgreb centriole dobbeltarbejde og synes ikke at påvirke andre væsentlige celle processer ² . Disse undersøgelser viste, at tiden forud for indledningen af ​​blastomer division synes at være en udviklingsperiode modtagelig for hjælp Heat Shock som et redskab til specifikt at manipulere ploidi gennem centriole hæmning. Den underliggende årsag til den tilsyneladende selektivitet for varmechok på centriole overlapning er ukendt, men kan være relateret til en selektiv nedbrydning af centrosom substrukturer observeret under varmestress i visse celletyper, såsom leukocytter ^5.

Temporal synkronisering af embryonale deling opnås ved in vitro fertilisering (IVF). Anvendelse af ubehandlet sperm under befrugtning resulterer i diploide embryoner at ved HS2-induceret én-cyklus cytokinese stall bliver tetraploid. Anvendelse af UV-behandlede sædceller, som bærer tværbindinger som inaktiverer sit DNA, resulterer i gynogenetic haploide embryoner ^6, som ved HSII-induceret én-cyklus cytokinese stall bliver gynogenetic diploider ^2. På grund af den resulterende hele genomet overlapning, sidstnævnte gynogenetic diploider er homozygote på hvert enkelt locus tværs genomet. For koncis, henviser vi til gynogenetic haploide embryoner som "haploider", og homozygote gynogenetic diploide embryoner som "homozygote diploider". Hvis levedygtig og frugtbar, kan homozygote diploider bruges til at indlede sterile og dødelige-fri linjer. Direkte homozygoti induceret af HS2 bør også let inkorporeres i genetisk analyse eller genetiske skærme, da homozygote diploider fra hundyr, som er heterozygote bærere af muttioner udviser satser homozygositet ved høje og faste (50%) nøgletal ^2.

Følgende protokol beskriver trin for at udføre HS2 og inducerer ploidi overlapning med fuld homozygoti. For tetraploid produktion, bør sperm løsning være ubehandlet. For homozygot diploid produktion, bør sperm inaktiveres ved UV-behandling. Endvidere som beskrevet i diskussionen, synlige pigment markører kan også anvendes til at lette identifikation af homozygote diploider. Zebrafisk mate primært i den første 3 timer om indledningen af deres lys cyklus ^7, og både voksne og æg er følsomme over for døgnrytmen ^8, så de bedste resultater bør ske IVF procedure inden for denne periode.

Protocol

Alle eksperimenter dyr blev udført i henhold til University of Wisconsin – Madison og Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer (University of Wisconsin – Madison Assurance nummer A3368-01). 1. Valg af Hunner for Egg Collection via afbrudt Parring BEMÆRK: IVF-baserede protokoller stole på ekstrudering af modne æg fra kvinder via manuel tryk 9. Tidligere protokoller har benyttes hundyr direkte fra tanke eller i par parringer uden hunnerne undergår æg frigivelse adfærd…

Representative Results

På trods af en-cellecyklus cytokinese stall, DNA-replikation forekommer normalt i sådanne embryoner, hvilket resulterer i overlapning af DNA-indholdet af embryo (figur 1). Den Streisinger Heat Shock protokol (standard HS) involverer en varme puls i perioden 13-15 minutter efter befrugtning (MPF) og inducerer primært cytokinese anholdelse under den første embryonale celledeling ved 35 MPF 1,2, mens den afledte her beskrevne fremgangsmåde, benævnt Heat sho…

Discussion

Kritiske trin

Det er afgørende at arbejde under forhold med effektiv in vitro-befrugtning. For at sikre et godt udbud af modne æg (trin 1), hunner oprettet til parring ikke burde have været oprettet i parring kors i mindst 5 dage og skal vises gravid. Under afbrydelse af avl, kan en observatør overvåge 15-30 tanke tilstrækkeligt for den første forekomst af naturlige æg ekstrudering. Afbrydelse af parring bør ske så hurtigt som muligt, når de første æg er frigivet gennem naturlige p…

Materials

Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5	see above	see above	1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)