Summary

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Published: December 16, 2016
doi:

Summary

ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir.

Abstract

ploidinin Manipülasyon gibi diploidlerin için tetraploids için diploidlerin veya haploidlerden gibi yararlı dönüşümler için izin verir. Tek bir heterozigot anneden homozigot doğrudan üretimini sağlar, çünkü zebra balığı Danio rerio olarak, özellikle homozigot jinogenetik diploid nesil genetik analizinde yararlıdır. Bu makalede, ilk hücre döngüsü, Isı Şok 2 (HS2) sırasında ısı nabız dayalı ploidi çoğaltma için modifiye edilmiş bir protokol tanımlamaktadır. centriole çoğaltılması inhibisyonu yoluyla, bu yöntem, ikinci bir hücre döngüsü sırasında hassas hücre bölünmesi durak ile sonuçlanır. etkilenmemiş DNA çoğaltılması ile birlikte hassas bir döngüsü bölümü durak, tüm genom çoğaltılması sonuçlanır. Bu yöntem ile ilgili protokoller tek hücre döngüsü bölünmesi gecikme ve Ploidi tekrarını neden yumurta ve sperm toplama, sperm UV tedavisi, in vitro fertilizasyon ve ısı darbesi bulunmaktadır. Bu protokolün değiştirilmiş bir versiyonu uygulanabilirDiğer hayvan türleri ploid değişikliğine neden.

Introduction

Bu protokol, jinogenetik haploidlerin (Şekil 1) ya da tetraploids üretimi homozigot jinogenetik diploid üretimi gibi zebra balığı embriyolar bölgesi ploidinin işleme izin verir. Bu tam bir hücre döngüsü (Şekil 2A, 2B) karşılık gelen sitokinez bir gecikme uyarılması ile elde edilir. sitokinez önemli bir döngü gecikmesi ısı şoku ile muamele ile elde edilmektedir. Orijinal olarak Streisinger ve arkadaşları tarafından tarif Isı Shock (HS) standart protokol ilk hücre döngüsü 1 sırasında bir döngüsü hücre bölünmesi durak sonuçlanan dönem 13-15 MPF'e sırasında sıcaklık darbe yer. Bu protokolün etkinliği son zamanlarda ısı şok tedavi kayan zamansal pencere ile erken hücre döngüleri tarayarak geliştirilmiştir. Bu tarama, hala ilk hücre döngüsünün (22-24 mpf) içinde, bir ısı şok daha sonraki bir zaman noktası tespit olduğunu EMBR daha yüksek bir oranda sonuçlarıBu durumda, ikinci bir hücre döngüsü 2 etkileyen bir döngüsü hücre bölünmesi durak ile yo. İlk hücre döngüsü sırasında deneysel manipülasyonlar ikinci hücre döngüsü sırasında hücre bölünmesi ile müdahale ve DNA içeriği tekrarını neden gözlem diğer balık türlerinin 3,4 rapor edilmiştir. terimi "2" ısı darbesinin, standart HS yöntemi daha sonraki bir zaman noktasında meydana gelmesi ve HS2 neden olduğu hücre döngüsü gecikmesi ikinci bir hücre döngüsü sırasında meydana yansıtır – Biz Isı Şoku 2 (HS2 olarak tadil edilmiş protokole bakınız ). Bu çalışmalar, ısı şokundan sonra sitokinez tutuklama temeli aşağıdaki hücre döngüsünde iğ oluşumunu ve karık indüksiyon etkileyen ısı darbesi sırasında centriole çoğaltılması engellenmesi olduğunu göstermiştir. HS2% 100 yaklaşıyor hücre döngüsü tutuklama verimleri sonuçları ve standart HS 2'den 4 kez daha yüksek Ploidi çoğaltılması up oranları.

Embriyolar tedavi zekâha blastomer hücresi devir esnasında ısı şoku birçok zararlı etkileri gösterirler, bu ısı şoku düşündüren hücre bölünmesi 2 için gerekli çoklu süreçleri etkiler. Isı şok hücre bisiklet (süre 0-30 mpf) başlamadan önce uygulandığında Öte yandan, centriole çoğaltılması ile özel girişim ile tutarlı etkilere sahip görünüyor ve diğer temel hücre süreçlerini 2 etkileyecek gibi görünmüyor . Bu çalışmalar blastomer bölünme başlamadan önce zaman özellikle centriole inhibisyonu yoluyla ploidi işlemek için bir araç olarak ısı şok kullanarak mükellef bir gelişimsel dönem gibi görünüyor gösterdi. Centriole çoğaltılması ısı şok belirgin bir seçicilik altında yatan nedeni bilinmemektedir, ancak örneğin lökositler 5 gibi bazı hücre tiplerinde, ısı stresi altında gözlenen sentrozom alt yapılar, seçici bir bozulma ile ilişkili olabilir.

embriyonik de zamansal senkronizasyonuvelopment in vitro fertilizasyon (IVF) ile elde edilir. üzerine tetraploid hale tek döngüsü sitokinez durak HS2 kaynaklı diploid embriyolar gübreleme sonuçları sırasında işlenmemiş sperm kullanımı. DNA'sını inaktive çapraz bağlantılar, bir döngü sitokinez durma jinogenetik diploitler 2 olur HSII kaynaklı üzerine jinogenetik haploid embriyolar 6, sonuçlar taşıyan UV ile muamele edilmiş sperm, kullanımı. Çünkü ortaya çıkan tüm genom çoğaltılması, ikincisi jinogenetik diploitler genom boyunca her loküsündeki homozigot bulunmaktadır. özlülük için, biz "haploidlerden" ve "homozigot diploid" olarak homozigot jinogenetik diploid embriyolar olarak haploit embriyolar jinogenetik bakın. yaşayabilir ve fertil ise, homozigot diploitler steril ve ölümcül içermeyen hatları başlatmak için kullanılabilir. HS2 tarafından uyarılan doğrudan homozigotlu¤u de kolayca mut heterozigot taşıyıcısı olan kadınlarda homozigot diploidlerin beri, genetik analiz veya genetik ekranlar dahil edilmelidiryüksek ve sabit (% 50) oranlarında 2 de homozigotluğu ve ations sergi oranları.

Aşağıdaki protokol HS2 gerçekleştirmek ve tam homozigotluğu ile Ploidi tekrarını ikna etmek için gereken adımları açıklar. tetraploid üretimi için, spermin çözeltisi muamele edilmemiş olmalıdır. homozigot diploid üretimi için, spermin, UV muamele ile inaktive edilmelidir. Tartışmada tarif edildiği gibi ek olarak, gözle görülebilir pigment belirteçler homozigot diploid belirlenmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir. En iyi sonuçlar için IVF işlemi bu süre içinde meydana gelmelidir yüzden öncelikle ışık döngüsüne 7 ve hem yetişkinler hem de yumurta inisiyasyon ilk 3 saat boyunca balığı arkadaşı, sirkadiyen ritimler 8 duyarlıdır.

Protocol

Madison ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuzların (University of Wisconsin – – Madison Güvence numarası A3368-01) Tüm hayvan deneyleri Wisconsin Üniversitesi göre yapılmıştır. 1. Interrupted Çiftteşme aracılığıyla Yumurta Toplama için Females seçme NOT: IVF-tabanlı protokoller manuel basınç ile 9 arasındaki kadınlarda olgun yumurta ekstrüzyon güveniyor. Önceki protokoller yumurta bırakma davranışı geçiren kadınlarda olmadan tanklar?…

Representative Results

Bir hücre döngüsü sitokinez durak rağmen, DNA replikasyon embriyo (Şekil 1) DNA içeriğinin tekrarlardan sonuçlanan, embriyolar, normal olarak ortaya çıkar. Streisinger Isı Şok protokolü (standart HS) dönemi 13-15 dakika sonra döllenme (mpf) sırasında ısı nabız içerir ve türetilmiş bir yöntem burada açıklanan ise 35 mpf 1,2 ilk embriyonik hücre bölünmesi sırasında öncelikle sitokinez tutuklama indükler, Isı Şok 2 (HS2), döne…

Discussion

kritik adımlar

In vitro fertilizasyon etkili koşullar altında çalışmak için çok önemlidir. olgun yumurta (adım 1) iyi bir tedarik sigortalamak için dişiler çiftleşmek için ayarlanmış en az 5 gün süreyle çiftleşme haç kurulmuş olmamalıdır ve gebe görünmelidir. ıslahının kesinti sırasında, bir gözlemci doğal yumurta ekstrüzyon ilk görünüm için yeterli 15-30 tankları izleyebilirsiniz. İlk yumurtalar çoğu yumurta IVF işlemi için kadın iç kalmasını sa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Materials

Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5 see above see above 1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

References

  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
  2. Heier, J., Takle, K., Hasley, A., Pelegri, F. Ploidy manipulation and induction of alternate clevage patterns through inhibition of centrosome duplication in the early zebrafish embryo. Dev. Dyn. 244, 1300-1312 (2015).
  3. Zhang, X., Onozato, H. Hydrostatic pressure treatment during the first mitosis does not suppress the first cleavage but the second one. Aquaculture. 240, 101-113 (2004).
  4. Zhu, X. P., You, F., Zhang, P. J., Xu, J. H., Sun, W. Effects of hydrostatic pressure on microtubule organization and cell cycle in gynogenetically activated eggs of olive flounder (Paralichthys olivaceus). Theriogenology. 68, 873-881 (2007).
  5. Vertii, A., Zimmerman, W., Ivshina, M., Doxsey, S. Centrosome-intrinsic mechanisms modulate centrosome integrity during fever. Mol. Biol. Cell. 26, 3451-3463 (2015).
  6. Walker, C., Detrich, W. H., Westerfield, M., Zon, L. I. . The zebrafish: Genetics and genomics. Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 43-70 (1999).
  7. Blanco-Vives, B., Sánchez-Vázquez, F. J. Synchronisation to light and feeding time of circadian rhythms of spawning and locomotor activity in zebrafish. Physiol. Behav. 98, 268-275 (2009).
  8. Dekens, M. P. S., et al. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2051-2057 (2003).
  9. Pelegri, F., Schulte-Merker, S., Detrich, W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics and Genomics Vol. 60 Methods in Cell Biology. , 1-20 (1999).
  10. Hart, N. H., Becker, K. A., Wolenski, J. S. The sperm entry site during fertilization of the zebrafish egg: localization of actin. Mol. Reprod. Dev. 32, 217-228 (1992).
  11. Tsaadon, A., Eliyahu, E., Shtraizent, N., Shalgi, R. When a sperm meets an egg: block to polyspermy. Mol. Cell. Endocrinol. 252, 107-114 (2006).
  12. Wong, J. L., Wessel, G. M. Defending the zygote: search for the ancestral animal block to polyspermy. Curr. Top. Dev. Biol. 72, 1-151 (2006).
  13. Rappaport, R., Rappaport, B. N. Establishment of cleavage furrows by the mitotic spindle. J. Exp. Zool. 189, 189-196 (1974).
  14. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W. I., Mitchinson, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr. Biol. 20, 2040-2045 (2010).
  15. Yabe, T., Ge, X., Pelegri, F. The zebrafish maternal-effect gene cellular atoll encodes the centriolar component Sas-6 and defects in its paternal function promote whole genome duplication. Dev. Biol. 312, 44-60 (2007).
  16. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes Dev. 18, 1527-1532 (2004).
  17. Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank’s saline containing bovine serum albumin. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6, 84-87 (1997).
  18. Roco, A. S., Olmstead, A. W., Degitz, S. J., Amano, T., Zimmerman, L. B., Bullejos, M. Coexistence of Y, W, and Z sex chromosomes in Xenopus tropicalis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 4752-4761 (2015).
  19. Streisinger, G., Singer, F., Walker, C., Knauber, D., Dower, N. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112, 311-319 (1986).
  20. Dekens, M. P. S., Pelegri, F. J., Maischein, H. -. M., Nüsslein-Volhard, C. The maternal-effect gene futile cycle.is essential for pronuclear congression and mitotic spindle assembly in the zebrafish zygote. Development. 130, 3907-3916 (2003).
  21. Pelegri, F., Mullins, M., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. . Met. Cell Biol. Vol. 104. , 83-120 (2011).

Play Video

Cite This Article
Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

View Video