Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Summary

Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.

Abstract

Manipulation von Ploidie ermöglicht nützliche Umwandlungen, wie Diploide zu tetraploiden oder Haploiden zu diploiden. Im Zebrabärblingen, insbesondere die Erzeugung von homozygot gynogenetischen diploiden ist in der genetischen Analyse nützlich , weil sie die direkte Herstellung von Homozygoten aus einer einzigen heterozygot Mutter erlaubt. Dieser Artikel beschreibt ein modifiziertes Protokoll für die Duplizierung Ploidie basierend auf einem Wärmeimpuls während des ersten Zellzyklus, Heat Shock 2 (HS2). Durch Hemmung der centriole Vervielfältigung führt dieses Verfahren in einer präzisen Zellteilung Stand während des zweiten Zellzyklus. Die genaue Ein-Zyklus-Teilung Stall, gekoppelt unbeeinflusst DNA Vervielfältigung, ergibt sich ganze Genomduplikation. Protokolle mit diesem Verfahren verbunden sind Ei- und Samensammlung, UV – Behandlung von Spermien, in – vitro – Fertilisation und Wärmeimpuls eine Ein-Zellzyklus – Abteilung Verzögerung und Ploidie Doppelarbeit zu verursachen. Eine modifizierte Version dieses Protokolls könnte angewendet werdenPloidie Veränderungen in anderen Tierarten zu induzieren.

Introduction

Dieses Protokoll ermöglicht die Manipulation von Ploidie in Zebrabärbling – Embryonen, beispielsweise bei der Erzeugung von homozygoten gynogenetischen Diploiden von gynogenetischen Haploiden (Abbildung 1) oder die Herstellung von tetraploiden. Dies wird durch Induzieren einer Verzögerung in Zytokinese erreicht genau einem Zellenzyklus entspricht (2A, 2B). Der Schlüssel von einem Zyklus Verzögerung in cytokinesis wird durch Behandlung mit Hitzeschock erreicht. Das Standardprotokoll von Hitzeschock (HS) , wie ursprünglich von Streisinger und Kollegen beteiligt einen Temperaturimpuls während des Zeitraums 13-15 MPF, was zu einer Ein-Zyklus der Zellteilung Strömungsabriß während des ersten Zellzyklus – ^1. Die Effizienz dieses Protokolls wurde durch Scannen der frühen Zellzyklen mit einem gleitenden Zeitfenster von Hitzeschockbehandlung vor kurzem verbessert. Dieser Scan einen späteren Zeitpunkt für einen Wärmeschock, noch innerhalb des ersten Zellzyklus (22-24 MPF), die zu einer höheren Rate von embr identifiziertenYos mit einem Zellteilungsströmungsabriß one-Zyklus, der in diesem Fall ² mit der zweiten Zellzyklus wirkt. Die Beobachtung , dass experimentelle Manipulationen während des ersten Zyklus Zelle mit der Zellteilung in der zweiten Zellzyklus stören und DNA – Gehalt Vervielfältigung verursachen wurde auch bei anderen Fischarten ^3,4 berichtet worden. Wir bezeichnen diese modifizierten Protokoll als Heat Shock 2 (HS2 – der Begriff "2" anzeigt, dass der Wärmeimpuls zu einem späteren Zeitpunkt erfolgt als die Standard HS-Methode, und dass der Zellzyklus-Verzögerung durch HS2 tritt während der zweiten Zellzyklus ). Diese Studien zeigten, dass die Grundlage für die Cytokinese Verhaftung nach Hitzeschock ist die Hemmung der centriole Duplizierung während des Wärmeimpulses, der Spindelbildung und Furche Induktions in der folgenden Zellzyklus wirkt. HS2 Ergebnisse in Ausbeuten von Arrest des Zellzyklus 100% nähert, und die Sätze der Ploidie Vervielfältigung bis zu 4 – mal höher als Standard HS ^2.

Die Embryonen behandelt Witzha Hitzeschock während Blastomere Zellzyklus viele schädliche Wirkungen zeigen, was darauf hindeutet , dass die Hitzeschock wirkt sich für die Zellteilung ² mehrere Prozesse erforderlich. Auf der anderen Seite, wenn die Hitzeschock vor der Einleitung des Zellzyklus (Zeitraum 0-30 MPF) angewendet wird, scheint es , Auswirkungen im Einklang mit spezifischen Störungen centriole Doppelarbeit zu haben und scheint nicht andere wesentliche Zellprozesse ² zu beeinflussen . Diese Studien zeigten, dass die Zeit vor dem Beginn der Blastomere Teilung wird eine Entwicklungsperiode zugänglich Verwendung Heat Shock als Werkzeug zu sein, um spezifisch Ploidie durch centriole Hemmung manipulieren. Die zugrunde liegende Ursache der scheinbaren Selektivität für Hitzeschock auf centriole Vervielfältigung ist nicht bekannt, kann aber auf einen selektiven Abbau von Zentrosomen Substrukturen beobachtet unter Hitzestress in bestimmten Zelltypen, wie beispielsweise Leukozyten ⁵ bezogen werden.

Die zeitliche Synchronisation der embryonalen dewicklung wird durch In-vitro-Fertilisation (IVF) erreicht. Verwendung von unbehandeltem Sperma bei der Befruchtung führt zu diploiden Embryonen, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall werden tetraploiden HS2-induziert. Die Verwendung von UV-behandelten Spermien, die Vernetzungen trägt, die ihre DNA zu inaktivieren, die Ergebnisse in gynogenetischen haploiden Embryonen ^6, die auf einem Zyklus cytokinesis Stall gynogenetischen diploiden ² werden-HSII induziert. Aufgrund der daraus resultierenden ganze Genomduplikation sind die letzteren gynogenetischen diploiden über das Genom in jedem einzelnen Locus homozygot. Für Prägnanz verweisen wir haploiden Embryonen als "Haploiden", und homozygote gynogenetischen diploiden Embryonen als "homozygot diploiden" zu gynogenetischen. Wenn lebensfähige und fruchtbare können homozygot diploiden verwendet werden steril und tödlich freien Linien zu initiieren. Direkte homozygosity induziert durch HS2 sollte auch leicht in die genetische Analyse oder genetischen Screens eingebaut werden, da homozygot diploiden von Weibchen, die heterozygote Träger von mut sindtionen zeigen Raten von Homozygotie bei hohen und festen (50%) -Verhältnisse ^2.

Das folgende Protokoll beschreibt Schritte HS2 auszuführen und Ploidie Vervielfältigung mit voller homozygosity induzieren. Für tetraploiden Produktion sollte Spermien Lösung unbehandelt sein. Für homozygote diploiden Produktion, Sperma sollte durch UV-Behandlung inaktiviert werden. Darüber hinaus können auch Identifizierung von homozygoten diploiden verwendet werden, wie in der Diskussion, sichtbaren Pigmentmarkern beschrieben zu erleichtern. Zebrabärbling Kumpel in erster Linie während der ersten 3 Stunden nach Einleitung ihrer Licht – Zyklus ⁷ und Erwachsene und Eier sind empfindlich auf zirkadianen Rhythmen ^8, so dass für die besten Ergebnisse der IVF – Verfahren innerhalb dieser Frist erfolgen soll.

Protocol

Alle Tierversuche wurden nach University of Wisconsin durchgeführt – Madison und Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien (University of Wisconsin – Madison Assurance Anzahl A3368-01). 1. Auswahl Frauen für Eiersammlung über Interrupted Mating HINWEIS: IVF-basierte Protokolle stützen sich auf die Extrusion von reifen Eizellen von Frauen durch manuellen Druck 9. Vorherige Protokolle haben Frauen direkt aus den Tanks oder in Paar Paarungen ohne die Weibchen unterziehen E…

Representative Results

Trotz des Stalles ein Zellzyklus Zytokinese tritt die DNA – Replikation normalerweise in solchen Embryonen, die sich in der Vervielfältigung der DNA – Gehalt des Embryos (Abbildung 1). Das Streisinger Heat Shock – Protokoll (Standard HS) beinhaltet einen Wärmeimpuls während der Zeit von 13 bis 15 Minuten nach der Befruchtung (MPF) und induziert in erster Linie cytokinesis Verhaftung während der ersten embryonalen Zellteilung bei 35 MPF 1,2, während die ab…

Discussion

Kritische Schritte

Es ist wichtig, unter den Bedingungen einer wirksamen in-vitro-Fertilisation zu arbeiten. Um eine gute Versorgung mit reifen Eier (Schritt 1) ​​zu gewährleisten, Frauen setzen für die Paarung sollte nicht wurden in Paarungs Kreuze für mindestens 5 Tage festgelegt und sollte gravide erscheinen. Während Unterbrechung der Zucht, kann ein Beobachter 15-30 Tanks ausreichend für das erste Auftreten von natürlichen Ei Extrusion überwachen. Unterbrechung der Paarung sollte…

Materials

Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5	see above	see above	1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)