Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Summary

Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.

Abstract

Manipulação de ploidia permite transformações úteis, tais como diplóides para tetraploids, ou haplóides para diplóides. No peixe-zebra Danio rerio, especificamente a geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos é útil na análise genética, porque permite a produção directa de homozigotos de um único mãe heterozigótica. Este artigo descreve um protocolo modificado para a duplicação de ploidia com base num impulso de calor durante o primeiro ciclo celular, choque térmico 2 (HS2). Através da inibição de duplicação centriole, este método resulta em uma tenda preciso divisão celular durante o segundo ciclo celular. A baia de divisão de um ciclo preciso, acoplado a duplicação DNA afetado, resulta na duplicação do genoma inteiro. Protocolos associados com este método incluem ovo e esperma recolha, tratamento com UV de esperma, fertilização in vitro e pulso de calor para provocar um atraso da divisão do ciclo de uma célula e a duplicação de ploidia. Uma versão modificada deste protocolo pode ser aplicadopara induzir alterações de ploidia em outras espécies animais.

Introduction

Este protocolo permite a manipulação de ploidia de embriões de peixe-zebra, tal como na geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos de haplóides ginogenéticos (Figura 1) ou a produção de tetraplóides. Isto é conseguido através da indução de um atraso na citocinese correspondente a precisamente um ciclo celular (Figura 2A, 2B). O atraso tecla de um ciclo na citocinese é conseguido por tratamento com choque térmico. O protocolo padrão de Choque Térmico (SH) como originalmente descrito por Streisinger e colegas envolvido um impulso de temperatura durante o período de MPF 13-15, resultando em uma tenda a divisão celular de um ciclo durante o primeiro ciclo celular ^1. A eficiência deste protocolo foi recentemente melhorado pela digitalização dos ciclos celulares início com uma janela deslizante temporal do tratamento de choque térmico. Esta verificação identificado um ponto de tempo depois de um choque de calor, ainda dentro do primeiro ciclo celular (22-24 MPF), que resulta em uma maior taxa de EMBRyos com uma tenda a divisão celular de um ciclo, que neste caso afecta o segundo ciclo celular ^2. A observação de que as manipulações experimentais durante o primeiro ciclo celular interferir com a divisão celular durante o segundo ciclo celular e causar a duplicação do ADN conteúdo também tem sido relatada em outras espécies de peixe ^3,4. Referimo-nos a este protocolo modificado como Choque Térmico 2 (HS2 – o termo "2" indica que o impulso de calor ocorre num ponto de tempo mais tarde do que o método HS padrão, e que o atraso do ciclo celular causado por HS2 ocorre durante o segundo ciclo celular ). Estes estudos mostraram que a base de prisão citocinese após o choque térmico é a inibição de duplicação centriole durante o impulso de calor, o que afecta a formação do fuso e indução sulco no seguinte ciclo celular. Resultados HS2 em rendimentos de parada do ciclo celular se aproximando de 100%, e as taxas de ploidia duplicação até 4 vezes superior HS standard ^2.

sagacidade embriões tratadosha choque térmico durante o ciclo celular blastomere apresentam muitos efeitos deletérios, sugerindo que o choque térmico afeta vários processos necessários para a divisão celular ^2. Por outro lado, se o choque de calor é aplicada antes do início do ciclo celular (período de tempo de 0-30 MPF), parece ter efeitos consistentes com interferência específica com a duplicação centriole e não parece afectar outros processos celulares essenciais ² . Estes estudos mostraram que o tempo antes da iniciação da divisão blast�ero parece ser um período de desenvolvimento passível de choque térmico utilizando como ferramenta para manipular especificamente através da inibição de ploidia centriole. A causa subjacente da aparente selectividade para a choque térmico na duplicação centríolo é desconhecida, mas pode estar relacionada a uma degradação seletiva de subestruturas centrossoma observados em estresse por calor em certos tipos de células, como leucócitos ^5.

sincronização temporal de embrionáriosenvolvimento é conseguido por fertilização in vitro (FIV). O uso de esperma não tratada durante resultados de fertilização em embriões diplóides que após a HS2 induzidas por um ciclo tenda cytokinesis tornar tetraploid. O uso de espermatozóides tratados com UV, que transporta ligações cruzadas que inativam o seu DNA, resulta em embriões haplóides ginogenéticos ^6, que após HSII induzidas por um ciclo cytokinesis tenda tornar diplóides ginogenéticos ^2. Devido a toda a duplicação do genoma, resultando, os últimos ginogenéticos diplóides são homozigóticos em cada locus único em todo o genoma. Para concisão, nos referimos a ginogenéticos embriões haplóides como "haplóides" e embriões diplóides ginogenéticos homozigotos como "diplóides homozigotos". Se viáveis ​​e férteis, diplóides homozigóticos pode ser utilizado para iniciar linhas estéreis e letais-livre. homozygosity direta induzida por HS2 deve também ser facilmente incorporados na análise genética ou telas genéticas, uma vez que diplóides homozigotos de fêmeas que são portadores heterozigotos de Muttaxas de exposição ções de homozigose em altas e fixas (50%) rácios ^2.

O protocolo a seguir descreve etapas para executar HS2 e induzem a duplicação ploidy com homozigose completa. Para a produção tetraplóide, solução de esperma deve ser tratada. Para a produção de diplóide homozigótica, o esperma deve ser inactivado por tratamento com UV. Além disso, como descrito na discussão, marcadores de pigmentos visíveis pode também ser usado para facilitar a identificação dos diplóides homozigóticos. Companheiro de peixe-zebra, principalmente durante a primeira 3 horas do início do seu ciclo de luz ^7, e ambos os adultos e os ovos são sensíveis aos ritmos circadianos ^8, portanto, para obter os melhores resultados do procedimento de fertilização in vitro deve ocorrer dentro deste período de tempo.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a University of Wisconsin – Madison e Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC) (University of Wisconsin – Madison Assurance número A3368-01). 1. Seleção de fêmeas para coleta de ovos via acasalamento Interrompida NOTA: protocolos baseados em FIV contar com a extrusão dos óvulos maduros de fêmeas através de pressão manual 9. protocolos anteriores usaram fêmeas diretamente de tanques ou em acasalamentos …

Representative Results

Apesar de a uma célula-box ciclo citocinese, a replicação do ADN ocorre normalmente em tais embriões, o que resulta na duplicação do teor de ADN do embrião (figura 1). O protocolo Streisinger Choque Térmico (HS standard) envolve um pulso de calor durante o período de 13-15 minutos após a fertilização (MPF) e induz principalmente detenção cytokinesis durante a primeira divisão celular embrionária em 35 mpf 1,2, enquanto que o método derivado de…

Discussion

As etapas críticas

É fundamental para o trabalho em condições de efetiva em fertilização in vitro. Para garantir um bom suprimento de óvulos maduros (passo 1), as fêmeas configurado para o acasalamento não deveria ter sido criado em cruzes de acasalamento durante pelo menos 5 dias e deve aparecer grávida. Durante a interrupção da reprodução, um observador pode monitorar 15-30 tanques de forma adequada para a primeira aparição de extrusão de ovo natural. Interrupção de acoplam…

Materials

Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl	Sigma	920-1	to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon			available in most standard stores
Dissecting scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissecting forceps	Dumont	SS	available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source)	Nikon	SMZ645	or equivalent
Reflective light source (LED arms)	Fostec	KL1600 LED	or equivalent
Petri plates 10 cm diameter			any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml			any maker
Ice bucket			any maker
Pipetteman P-1000			any maker
Pipette tips 1000 µl			any maker
Narrow spatula	Fisher	14-374
Depression glass plate	Corning Inc	722085 (Fisher cat. No 13-748B)	available from Fisher Scientific
UV lamp	UVP	Model XX-15 (cat No. UVP18006201)	available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses			any maker
Paper towels			any maker
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	available from Fisher Scientific
Timer stop watch			any maker
Wash bottle	Thermo Scientific	24020500	available from Fisher Scientific
Tea strainer			available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2)	Corning Inc.	1000250	available from Fisher Scientific
water bath (2)			any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1	see above	see above	8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2	see above	see above	0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 4	see above	see above	0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 5	see above	see above	1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C.
Hank's Premix	see above	see above	add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4°C
Hanks’ Solution 6	see above	see above	0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution)	see above	see above	Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)