हीट शॉक 2 उपचार के साथ zebrafish भ्रूण की Ploidy हेरफेर
Summary
ploidy हेरफेर के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल जल्दी भ्रूण में cytokinesis में एक एक चक्र स्टाल प्रेरित करने के लिए एक गर्मी झटका उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल zebrafish में प्रदर्शन किया है, लेकिन अन्य प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
ploidy के हेरफेर ऐसे diploids को tetraploids को diploids, या haploids के रूप में उपयोगी परिवर्तनों, के लिए अनुमति देता है। Zebrafish Danio rerio में, विशेष रूप से homozygous gynogenetic diploids की पीढ़ी क्योंकि यह एक एकल विषमयुग्मजी मां से समयुग्मज के प्रत्यक्ष उत्पादन की अनुमति देता आनुवांशिक विश्लेषण में उपयोगी है। यह लेख पहले कोशिका चक्र, हीट शॉक 2 (HS2) के दौरान एक गर्मी नब्ज पर आधारित ploidy दोहराव के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन है। तारककेंद्रक दोहराव के निषेध के माध्यम से, इस विधि दूसरी कोशिका चक्र के दौरान एक सटीक कोशिका विभाजन के स्टाल में यह परिणाम है। सटीक एक चक्र विभाजन स्टाल, अप्रभावित डीएनए दोहराव के लिए युग्मित, पूरे जीनोम दोहराव में यह परिणाम है। इस विधि के साथ जुड़े प्रोटोकॉल एक एक कोशिका चक्र विभाजन देरी और ploidy दोहराव पैदा करने के लिए अंडे और शुक्राणु संग्रह, शुक्राणु की यूवी इलाज, इन विट्रो निषेचन और गर्मी नाड़ी शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण लागू किया जा सकताअन्य जानवरों की प्रजातियों में ploidy परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए।
Introduction
इस प्रोटोकॉल ऐसे gynogenetic haploids (चित्रा 1) या tetraploids के उत्पादन से homozygous gynogenetic diploids की पीढ़ी के रूप में zebrafish भ्रूण में ploidy के हेरफेर की अनुमति देता है। यह cytokinesis ठीक एक कोशिका चक्र (चित्रा 2A, 2 बी) के लिए इसी में देरी उत्प्रेरण द्वारा हासिल की है। cytokinesis में महत्वपूर्ण एक चक्र देरी गर्मी झटका साथ इलाज के द्वारा हासिल की है। हीट शॉक (एचएस) के रूप में मूल रूप से Streisinger और उनके सहयोगियों द्वारा वर्णित के मानक प्रोटोकॉल की अवधि 13-15 एमपीएफ के दौरान एक तापमान पल्स शामिल है, पहली सेल चक्र 1 के दौरान एक एक चक्र कोशिका विभाजन के स्टाल में जिसके परिणामस्वरूप। इस प्रोटोकॉल की दक्षता में हाल ही में गर्मी के झटके उपचार की एक रपट अस्थायी खिड़की के साथ जल्दी सेल चक्र स्कैनिंग द्वारा सुधार किया गया है। यह स्कैन, एक गर्मी सदमे के लिए एक बाद में समय बिंदु की पहचान की है, अभी भी पहली सेल चक्र (22-24 एमपीएफ) के भीतर है कि embr की एक उच्च दर में परिणामएक एक चक्र कोशिका विभाजन के स्टाल, जो इस मामले में दूसरी कोशिका चक्र को प्रभावित करता है 2 के साथ yos। अवलोकन है कि पहली सेल चक्र के दौरान प्रायोगिक जोड़तोड़ दूसरी कोशिका चक्र के दौरान कोशिका विभाजन के साथ हस्तक्षेप और डीएनए सामग्री दोहराव का कारण भी अन्य मछली प्रजातियों 3,4 में सूचना दी गई है। शब्द "2" को दर्शाता है कि गर्मी नाड़ी मानक एचएस विधि की तुलना में एक बाद में समय बिंदु पर होता है, और सेल चक्र HS2 की वजह से देरी दूसरी कोशिका चक्र के दौरान होता है कि – हम हीट शॉक 2 (HS2 के रूप में इस संशोधित प्रोटोकॉल के लिए देखें )। इन अध्ययनों से पता चला है कि गर्मी के झटके के बाद cytokinesis गिरफ्तारी के लिए आधार गर्मी नाड़ी है, जो धुरी के गठन और निम्न सेल चक्र में कुंड प्रेरण प्रभावित दौरान तारककेंद्रक दोहराव का निषेध है। सेल चक्र गिरफ्तारी की पैदावार में HS2 परिणाम 100% में होने जा रही है, और 4 गुना अधिक करने के लिए ploidy दोहराव अप मानक एच एस 2 की तुलना की दर।
भ्रूण में इलाज बुद्धिहा blastomere सेल साइकिल चालन के दौरान गर्मी झटका कई हानिकारक प्रभाव दिखा रहे हैं, कि गर्मी झटका सुझाव कई कोशिका विभाजन 2 के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है। दूसरी ओर, अगर गर्मी झटका सेल साइकिल चालन (समय अवधि 0-30 एमपीएफ) की दीक्षा से पहले लागू किया जाता है, यह तारककेंद्रक दोहराव के साथ विशिष्ट हस्तक्षेप के साथ लगातार प्रभाव है प्रकट होता है और अन्य आवश्यक सेल प्रक्रियाओं 2 को प्रभावित करने के लिए नहीं लगता है । इन अध्ययनों से पता चला है कि समय blastomere विभाजन की दीक्षा से पहले एक विकासात्मक अवधि के लिए एक उपकरण के रूप में हीट शॉक का उपयोग करते हुए विशेष रूप से तारककेंद्रक निषेध के माध्यम से ploidy में हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी होना प्रतीत होता है। तारककेंद्रक दोहराव पर गर्मी सदमे के लिए स्पष्ट चयनात्मकता के अंतर्निहित कारण अज्ञात है, लेकिन इस तरह के ल्यूकोसाइट्स 5 के रूप में कुछ प्रकार की कोशिकाओं में गर्मी तनाव के तहत मनाया केंद्रपिंड substructures, के एक चयनात्मक गिरावट से संबंधित हो सकता है।
भ्रूण डी के टेम्पोरल तुल्यकालनविकास के लिए इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) से हासिल की है। द्विगुणित भ्रूण में निषेचन परिणाम है कि इस पर HS2 प्रेरित एक चक्र cytokinesis स्टाल टेट्राप्लोइड बनने के दौरान इलाज शुक्राणु का प्रयोग करें। यूवी का इलाज शुक्राणु, crosslinks कि अपने डीएनए निष्क्रिय, gynogenetic अगुणित भ्रूण 6, जिस पर HSII प्रेरित एक चक्र cytokinesis स्टाल gynogenetic diploids 2 बनने में परिणाम वहन का प्रयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप पूरे जीनोम दोहराव की वजह से, उत्तरार्द्ध gynogenetic diploids जीनोम भर में हर एक ठिकाना पर homozygous हैं। संक्षिप्तता के लिए, हम "haploids", और "homozygous diploids" के रूप में homozygous gynogenetic द्विगुणित भ्रूण के रूप में अगुणित भ्रूण gynogenetic को देखें। व्यवहार्य और उपजाऊ हैं, homozygous diploids बाँझ और घातक मुक्त लाइनों आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। HS2 से प्रेरित प्रत्यक्ष homozygosity भी आसानी से महिलाओं है कि mut के विषमयुग्मजी वाहक हैं, से आनुवांशिक विश्लेषण या आनुवंशिक स्क्रीन में शामिल किया जाना चाहिए homozygous diploids के बादउच्च और निश्चित (50%) अनुपात 2 पर homozygosity की ations प्रदर्शनी दरों।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल HS2 प्रदर्शन और पूर्ण homozygosity साथ ploidy दोहराव के लिए प्रेरित करने के लिए कदम का वर्णन है। टेट्राप्लोइड उत्पादन के लिए, शुक्राणु समाधान इलाज होना चाहिए। homozygous द्विगुणित उत्पादन के लिए, शुक्राणु यूवी उपचार द्वारा निष्क्रिय किया जाना चाहिए। इसके अलावा, चर्चा में वर्णित है, दिखाई वर्णक मार्करों भी homozygous diploids की पहचान की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मुख्य रूप से अपने प्रकाश चक्र 7, और दोनों वयस्क और अंडे की दीक्षा के पहले 3 घंटे के दौरान Zebrafish दोस्त circadian लय 8 के प्रति संवेदनशील हैं, तो सबसे अच्छा परिणाम के लिए आईवीएफ प्रक्रिया इस समय अवधि के भीतर हो जाना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
महत्वपूर्ण कदम
यह इन विट्रो निषेचन में प्रभावी की शर्तों के तहत काम करने के लिए महत्वपूर्ण है। परिपक्व अंडे (चरण 1) की एक अच्छी आपूर्ति बीमा करने के लिए, महिलाओं को संभोग के लिए स्थापित की कम से …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.
Materials
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Pipetteman P-1000 | any maker | ||
| Pipette tips 1000 µl | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (cat No. UVP18006201) | available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting) |
| UV glasses | any maker | ||
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| Tea strainer | available in kitchen stores | ||
| beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| water bath (2) | any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series) | ||
| Hanks’ Solution 1 | see above | see above | 8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 2 | see above | see above | 0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 4 | see above | see above | 0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hanks’ Solution 5 | see above | see above | 1.23g MgSO4 ∙ 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4°C. |
| Hank's Premix | see above | see above | add, in the following order: 10.0 ml Solution 1; 1.0 ml Solution 2; 1.0 ml Solution 4; 86.0 ml ddH2O; 1.0 ml Solution 5. Store at 4°C |
| Hanks’ Solution 6 | see above | see above | 0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure. |
| Hank's Solution (final solution) | see above | see above | Combine 990ul of Hank’s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution) |
References
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