Capillaire elektroforese Monitor Peptide Enten op chitosan films in Real Time
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
Vrije oplossing capillaire electroforese (CE) scheidt analyten algemeen geladen verbindingen in oplossing door het aanleggen van een elektrisch veld. Vergeleken met andere analytische scheidingstechnieken zoals chromatografie, CE is goedkoop, robuust en effectief vereist geen monstervoorbereiding (voor een aantal complexe natuurlijke of polymère matrices monsters). CE is snel en kan worden gebruikt om de ontwikkeling van mengsels direct (bijvoorbeeld kinetica) volgen de signalen waargenomen voor de gescheiden verbindingen rechtstreeks evenredig met de hoeveelheid in oplossing.
Hier, is de efficiëntie van CE aangetoond voor controle op de covalent enten van peptiden op chitosan films voor daaropvolgende biomedische toepassingen. Chitosan's antimicrobiële en biocompatibele eigenschappen maken het een aantrekkelijk materiaal voor biomedische toepassingen zoals celgroei substraten. Covalent enten van het peptide RGDS (arginine – glycine -asparaginezuur – serine) op het oppervlak van chitosan films gericht op verbetering van celhechting. Historisch gezien chromatografie en aminozuuranalyse gebruikt om een directe meting van de hoeveelheid geënte peptide verschaffen. Echter, de snelle scheiding en afwezigheid van het monster voorbereiding door CE stelt even nauwkeurige nog real-time monitoring van het peptide enten proces. CE kan scheiden en kwantificeren van de verschillende componenten van het reactiemengsel: de (niet-geënte) peptide en chemische koppelingsmiddelen. Op deze wijze het gebruik van CE resulteert in verbeterde films voor verdere toepassingen.
De chitosan films werden gekarakteriseerd door middel van solid-state NMR (nucleaire magnetische resonantie) spectroscopie. Deze techniek is tijdrovend en kan in real time worden toegepast, maar levert een directe meting van het peptide en aldus valideert de CE-techniek.
Introduction
Vrije oplossing capillaire elektroforese (CE) is een techniek die verbindingen in oplossingen op basis van hun lading naar wrijvingsgetal 1,2 scheidt. Charge-gewicht verhouding wordt vaak genoemd in de literatuur, maar deze vereenvoudiging geldt niet polyelektrolyten, waaronder polypeptiden in dit werk, en bleek ook niet geschikt voor kleine organische moleculen 3 te zijn. CE verschilt van andere scheidingstechnieken, dat het geen stationaire fase slechts achtergrondelektrolyt (gewoonlijk een buffer) hebben. Hierdoor kan de techniek robuust zijn vermogen om een groot aantal monsters analyseren complexe matrices 4 zoals plantaardige vezels 5, fermentatie brouwsels 6 enting op synthetische polymeren 7, voedselsteekproeven 8, en nauwelijks oplosbare peptiden 9 zonder vervelende monstervoorbereiding en zijn zuivering. Dit is vooral van belang voor complexe polyelektrolyten die ontbinding kwesties (such als chitosan 10 en gellangom 11) en daarom bestaan als geaggregeerde of neergeslagen in oplossing en zijn met succes geanalyseerd zonder monster filtratie. Verder is de analyse van suikers in ontbijtgranen was het injecteren van monsters met deeltjes van granen monsters b geprecipiteerd in water 8. Dit geldt ook voor de analyse van vertakte polyelektrolyten of copolymeren 12,13. Uitgebreid werk is ook bij de ontwikkeling van technieken CE specifiek voor de analyse van eiwitten voor proteomics 14, chirale scheiding van natuurlijke of synthetische peptiden 15 en microchip scheidingen van eiwitten en peptiden 16 afgerond. Aangezien de scheiding en analyse plaatsvinden in een capillair worden slechts kleine hoeveelheden monster en oplosmiddelen die CE mogelijk maakt een lagere operationele kosten dan andere scheidingstechnieken zoals chromatografie 5,6,17 hebben. Aangezien de scheiding door CE is snel, kan de monitoring van de reactie kinetiek. Dit werd aangetoond bij het enten van peptiden op chitosan films voor betere celadhesie 18.
Chitosan is een polysaccharide afgeleid van de N -deacetylation chitine. Chitosan films kunnen gebruikt worden voor verschillende biomedische toepassingen zoals biologische hechtmiddelen 19 en celgroei substraten 18,20, vanwege chitosan van 21 biocompatibiliteit. Celhechting specifieke extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, collageen en laminine, is direct verbonden met de overleving van de cellen 22. Met name verschillende celtypen vereisen vaak hechting aan verschillende extracellulaire matrixeiwitten op overleving en goede werking. Celhechting chitosan films bleek worden verbeterd door het enten van 23 fibronectine; Echter, de voorbereiding, zuivering en enten van dergelijke grote eiwitten is economisch niet haalbaar. Afwisselend een reeks van kleine peptiden have aangetoond kunnen de eigenschappen van grote extracellulaire matrixeiwitten nabootsen. Bijvoorbeeld, peptiden zoals fibronectine mimetica RGD (arginine – glycine – asparaginezuur) en RGDS (arginine – glycine – asparaginezuur – serine) zijn gebruikt om vergemakkelijken en celhechting 24. Covalent enten van RGDS op chitosan films resulteerde in een verbeterde celbinding op cellen bekend te hechten aan fibronectine in vivo 18. Substitueren grotere eiwitten vindt fibronectine met kleinere peptiden die dezelfde functionaliteit levert een aanzienlijke kostenreductie.
Hier peptide enten chitosan werd uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd 18. Zoals eerder aangetoond, deze aanpak levert eenvoudige en efficiënte enting met de koppelingsmiddelen EDC-HCI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) en NHS (N-hydroxysuccinimide) om het carbonzuur van de RGDS te functionaliseren geënt op dechitosan film. Twee voordelen van deze enten methode zijn dat zij geen wijziging van de chitosan of van het peptide vereist, en wordt uitgevoerd in waterig medium compatibiliteit met toekomstige celcultuurtoepassingen 18,20 maximaliseren. Als de koppelingsmiddelen en het peptide kan worden opgeladen, CE is een geschikte methode voor de analyse van de reactiekinetiek. Belangrijker analyse van de reactiekinetiek via CE maakt real-time monitoring van de entreactie, en dus stelt beide optimaliseren en te kwantificeren van de mate van enten.
Hoewel het niet routinematig nodig kan de resultaten van de CE analyse gevalideerd off-line door een directe meting van het peptide enting op het chitosan films via solid-state NMR (kernspinresonantie) spectroscopie 25,26 aan de covalente enten tonen van het peptide op de film 18. Vergeleken met solid-state NMR spectroscopie, de real-time analyse doorCE maakt de kwantificering van het peptide in realtime en dus in staat zijn de kinetica van de reactie te evalueren.
Bovenstaande werkwijze is eenvoudig en maakt het real-time analyse van peptide enting op chitosan films indirecte kwantificering van de omvang van de enten. De aangetoonde werkwijze kan worden uitgebreid tot de real time kwantitatieve evaluatie van verschillende chemische reacties zolang de reactanten of de produkten worden onderzocht kunnen worden gebracht.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eenvoud van de hier beschreven protocol maakt het ideaal voor brede toepassing. Echter, bijzondere aandacht moet worden besteed aan de volgende belangrijke stappen.
Proper CE instrument voorbereiding
Het is belangrijk om een bekende standaard onmiddellijk voorafgaand aan de scheiding van onbekende monsters (en aan het einde van een reeks scheidingen) geïsoleerde de geldigheid van de capillair en het instrument op de dag controleren. Dez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. . in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. . Modern Analytical Chemistry. , (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -. D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O’Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
