אלקטרופורזה הנימים לפקח פפטיד האריך על Chitosan סרטים בזמן אמת
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
אלקטרופורזה נימים חינם-פתרון (CE) מפרידה analytes, תרכובות טעונות בדרך כלל פתרון באמצעות היישום של שדה חשמלי. לעומת טכניקות פרדה אנליטית אחרות, כגון כרומטוגרפיה, CE הוא זול, חזק ואפקטיבי לא דורש הכנת מדגם (במשך מספר מטריצות טבע מורכבות או דוגמאות פולימריות). CE הוא מהיר וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר האבולוציה של תערובות בזמן אמת (למשל, קינטיקה כימית תגובה), כמו האותות נצפו עבור התרכובות המופרדות הם ביחס ישר לכמות שלהם בתמיסה.
הנה, את היעילות של CE מודגמת לניטור השתלת קוולנטי של פפטידים על גבי סרטי chitosan עבור יישומים ביו שלאחר מכן. התכונות מיקרוביאלית ביולוגיות של Chitosan להפוך אותו חומר אטרקטיבי עבור יישומים ביו כגון מצעי צמיחת תאים. קוולנטית השתלת rgds פפטיד (ארגינין – גליצין -חומצה אספרטית – סרין) על פני השטח של סרטי chitosan שואפת לשפר מצורף תא. מבחינה היסטורית, כרומטוגרפיה וניתוח חומצת אמינו שימשו לספק מדידה ישירה של כמות פפטיד מורכבים. עם זאת, ההפרדה והיעדר המהירה של הכנת מדגם מסופקת על ידי CE מאפשרים פחות ניטור מדויק עדיין בזמן אמת של תהליך השתלת פפטיד. CE הוא מסוגל להפריד בין לכמת את המרכיבים השונים של תערובת התגובה: הפפטיד (לא מורכב) ואת סוכני הצימוד הכימי. בדרך זו את השימוש לספירת תוצאות בסרטים משופרים עבור יישומים במורד זרם.
סרטי chitosan אופיינו באמצעות ספקטרוסקופיית מצב מוצק NMR (תהודה מגנטית גרעינית). טכניקה זו דורשת זמן רב ולא ניתן ליישם בזמן אמת, אבל מניב מדידה ישירה של פפטיד ובכך מאמתת את טכניקת CE.
Introduction
אלקטרופורזה נימי פתרון חינם (CE) היא טכניקה שמפרידה תרכובות פתרונות המבוססים על 1,2 היחס האחראי ל-חיכוך שלהם. החיוב לגודל- יחס לעתים קרובות מוזכר בספרות, אבל פישוט זה אינו חל על polyelectrolytes, לרבות פוליפפטידים בעבודה זו, וגם הוצג לא להיות מתאים 3 מולקולות אורגניות קטנות. CE נבדל טכניקות הפרדה אחרות בכך שהוא לא מקיים בשלב נייח, אלקטרוליט רקע בלבד (בדרך כלל חיץ). זה מאפשר את הטכניקה כדי להיות חזקה ביכולתה לנתח מגוון רחב של דוגמאות עם מטריצות מורכבות 4 כגון סיבים צמחיים 5, מבשל תסיסה 6 השתלה על פולימרים סינטטיים 7, דגימות מזון 8, ופפטידים מסיסים כמעט 9 ללא הכנת מדגם מייגע טָהֳרָה. מדובר בהישג משמעותי עבור polyelectrolytes מורכבים אשר יש בעיות פירוק (יםuch כמו chitosan 10 ו gellan מסטיק 11) ולכן קיים כפי מצטבר או זרז בתמיסה כבר נותח בהצלחה ללא סינון מדגם. יתר על כן, הניתוח של סוכרי דגני בוקר מעורב הזרקת דגימות עם חלקיקים של דגימות דגני בוקר זרז במים 8. זה גם מרחיב את הניתוח של polyelectrolytes מסועף או קופולימרים 12,13. עבודה נרחבת גם הושלמה בפיתוח טכניקות CE במיוחד עבור ניתוח של חלבונים עבור פרוטאומיקה 14, ההפרדה כיראליות של פפטידים טבעיים או סינתטיים 15 והפרדות שבב של חלבונים ופפטידים 16. מאז ההפרדה והניתוח להתבצע בתוך נימים, רק בנפחים קטנים של מדגם וממסים משמשים המאפשרים CE יש עלות ריצה נמוכה יותר מאשר טכניקות הפרדה אחרות כולל 5,6,17 כרומטוגרפיה. מאז ההפרדה על ידי CE היא מהירה, הוא מאפשר לבקרהטבעת של קינטיקה התגובה. הדבר בא לידי ביטוי במקרה של השתלת פפטידים על גבי סרטי chitosan עבור הידבקות תא משופר 18.
Chitosan הינו פוליסכריד נגזר N -deacetylation של כיטין. ניתן להשתמש סרטי Chitosan עבור יישומים ביו שונים כגון bioadhesives 19 מצעי צמיחת תאי 18,20, בשל biocompatibility של chitosan 21. מצורפים תא חלבוני מטריצה ספציפית תאיים, כמו פיברונקטין, collagens ו laminin, קשור ישירות ההישרדות של התאים 22. יש לציין, תאים מסוגים שונים לעתים קרובות דורשים מצורפים חלבונים תאים מטריקס שונים להישרדות ותפקוד תקין. מצורף תא סרטי chitosan הוצג להיות משופר באמצעות השתלת פיברונקטין 23; עם זאת, הכנה, טיהור השתלת חלבונים גדולים כאלה אינה כלכליים. לחילופין מגוון של פפטידים קטנים havדואר הוכח להיות מסוגל לחקות את תכונות חלבונים מטריקס גדולים. לדוגמה, פפטידים כגון RGD mimetics פיברונקטין (ארגינין – גליצין – חומצה אספרטית) ו rgds (ארגינין – גליצין – חומצה אספרטית – סרין) שימשו כדי להקל ולהגדיל תא מצורף 24. קוולנטיים השתלת rgds על גבי סרטי chitosan הביאה מצורף תא משופר עבור תאים המכונים לצרף פיברונקטין in vivo 18. נציב חלבונים גדולים אוהב פיברונקטין עם פפטידים קטנים יותר, שיש אותה פונקציונלי מספקת צמצום משמעותי בעלויות.
הנה, פפטיד השתלה כדי chitosan בוצע כפי שפורסם בעבר 18. כפי שהוכח בעבר, גישה זו מספקת השתלת פשוטה ויעילה באמצעות סוכני צימוד EDC-HCl (1-אתיל-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) ו NHS (-hydroxysuccinimide N) כדי functionalize חומצה קרבוקסילית של rgds להיות מורכב על גביסרט chitosan. שני יתרונות של שיטה זו הם השתיל כי היא אינה דורשת שינוי כלשהו של chitosan או של הפפטיד, וזה מתבצע במדיום מימי על מנת למקסם את התאימות עם יישומי תרבית תאים בעתיד 18,20. כמו סוכני הצימוד ואת פפטיד ניתן לטעון, CE היא שיטה מתאימה לניתוח של קינטיקה התגובה. חשוב לציין, ניתוח של קינטיקה התגובה באמצעות CE מאפשר ניטור בזמן אמת של תגובת ההשתלה, ובכך מאפשר הוא ייעול לכימות מידת ההשתלה.
אמנם זה לא הכרחי באופן שגרתי, התוצאות של ניתוח CE ניתן תוקף off-line על ידי מדידה ישירה של הפפטיד השתיל על סרטי chitosan באמצעות NMR מצב מוצק (תהודה מגנטית גרעינית) ספקטרוסקופיה 25,26 כדי להדגים את השתלת קוולנטי של הפפטיד על הסרט 18. עם זאת, בהשוואה ל ספקטרוסקופיה NMR מצב מוצק, ניתוח בזמן אמת שמספקCE מאפשרת כימות של צריכת פפטיד בזמן אמת ובכך את היכולת להעריך את קינטיקה של התגובה.
השיטה הנ"ל היא פשוטה ומאפשרת הניתוח בזמן האמת של פפטיד השתלה גבי סרטי chitosan עם כימות עקיפה של מידת ההשתלה. השיטה הוכיחה ניתן להאריך את הערכה כמותית בזמן אמת של תגובות כימיות שונות כל עוד המגיבים או המוצרים להיות מנותח ניתן לטעון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפשטות של הפרוטוקול המתואר כאן עושה אותו אידיאלי כדי יישום נרחב. עם זאת, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולם כדי הצעדים העיקריים הבאים.
הכנת מכשיר לספירת פרופר
חשוב להפריד סטנדרט ידוע …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. . in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. . Modern Analytical Chemistry. , (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -. D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O’Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
