Electrophorèse Capillaire pour surveiller Peptide greffant sur chitosan Films en temps réel
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
capillaire libre solution électrophorèse (CE) sépare analytes, composés généralement pratiqués en solution par l'application d'un champ électrique. Par rapport à d'autres techniques de séparation analytiques, telles que la chromatographie, C'est pas cher, robuste et ne nécessite aucune préparation de l'échantillon (pour un certain nombre de matrices naturelles complexes ou des échantillons polymères) de manière efficace. C'est rapide et peut être utilisé pour suivre l'évolution des mélanges en temps réel (par exemple, la cinétique de réaction chimique), les signaux observés pour les composés séparés sont directement proportionnels à leur quantité dans la solution.
Ici, l'efficacité de la C'est mise en évidence pour la surveillance du greffage covalent de peptides sur des films de chitosane pour des applications biomédicales ultérieures. propriétés anti-microbiennes et biocompatibles de chitosan en font un matériau intéressant pour des applications biomédicales telles que les substrats de croissance cellulaire. greffage covalence les MFG peptidiques (arginine – glycine -l'acide aspartique – serine) sur la surface des films de chitosane vise à améliorer la fixation des cellules. Historiquement, la Chromatographie et l'analyse des acides aminés ont été utilisées pour fournir une mesure directe de la quantité de peptide greffé. Cependant, la séparation rapide et absence de préparation de l'échantillon fourni par CE permet la surveillance en temps réel aussi précise encore du procédé de greffage des peptides. C'est capable de séparer et quantifier les différents composants du mélange réactionnel: (non greffé), des peptides et des agents de couplage chimique. De cette manière, l'utilisation de CE conduit à des films améliorés pour les applications en aval.
Les films de chitosane ont été caractérisés par RMN du solide (résonance magnétique nucléaire) spectroscopie. Cette technique est plus chronophage et ne peut être appliqué en temps réel, mais on obtient une mesure directe du peptide et donc valide la technique de la CE.
Introduction
Capillaire solution gratuite électrophorèse (CE) est une technique qui sépare les composés dans des solutions basées sur leur ratio 1,2 charge-friction. Ratio-Charge à la taille est souvent mentionné dans la littérature, mais cette simplification ne concerne pas les polyélectrolytes, y compris des polypeptides dans ce travail, et a également été montré ne pas être approprié pour les petites molécules organiques 3. CE diffère d'autres techniques de séparation en ce qu 'il n'a pas une phase stationnaire, seul un électrolyte de fond (généralement un tampon). Cela permet à la technique pour être robuste dans sa capacité à analyser une large gamme d'échantillons avec des matrices complexes 4 telles que les fibres végétales 5, fermentation brassins 6 greffage sur des polymères synthétiques 7, des échantillons de produits alimentaires 8 et peptides difficilement solubles 9 sans préparation de l' échantillon fastidieux et purification. Ceci est particulièrement significatif pour les polyélectrolytes complexes, qui ont des problèmes de dissolution (Such comme chitosane 10 et la gomme gellane 11) et donc exister sous forme agrégée ou précipité en solution et ont été analysés avec succès sans filtration de l' échantillon. En outre, l'analyse des sucres dans céréales de petit déjeuner impliqué injectant des échantillons avec des particules d'échantillons de céréales de petit déjeuner précipité dans l' eau 8. Cela va également à l'analyse des polyélectrolytes ou des copolymères ramifiés 12,13. Un travail considérable a également été accompli dans le développement de techniques CE spécifiquement pour l'analyse des protéines pour la protéomique 14, séparation chirale des peptides naturels ou synthétiques 15 et les séparations des micropuces de protéines et de peptides 16. Depuis la séparation et l' analyse ont lieu dans un capillaire, seulement de petits volumes d'échantillon et les solvants sont utilisés , ce qui permet CE d'avoir un coût de fonctionnement inférieur à d' autres techniques de séparation , y compris la chromatographie 5,6,17. Depuis la séparation par C'est rapide, il permet à l'monitoanneau de la cinétique de réaction. Cela a été démontré dans le cas du greffage de peptides sur des films de chitosane pour une meilleure adhérence des cellules 18.
Le chitosan est un polysaccharide dérivé du N -deacetylation de la chitine. Des films de chitosan peuvent être utilisées pour diverses applications biomédicales telles que 19 bioadhésifs et des substrats de croissance cellulaire 18,20, en raison de la biocompatibilité du 21 chitosane. La fixation des cellules aux protéines de la matrice extracellulaire spécifiques, telles que la fibronectine, la laminine et les collagènes, est directement liée à la survie des cellules 22. En particulier, différents types de cellules nécessitent souvent la fixation de différentes protéines de la matrice extracellulaire pour la survie et le bon fonctionnement. La fixation des cellules à des films de chitosane a été montré être amélioré par le greffage de 23 fibronectine; Cependant, la préparation, la purification et le greffage de ces grandes protéines ne sont pas économiquement viables. Alternativement une gamme de petits peptides VHAe sont révélés être capables d'imiter les propriétés des grandes protéines de la matrice extracellulaire. Par exemple, des peptides tels que les mimétiques de fibronectine RGD (arginine – glycine – acide aspartique) et MFG (arginine – glycine – acide aspartique – sérine) ont été utilisées pour faciliter et accroître l' attachement des cellules 24. Covalent greffage de MFG sur des films chitosane a permis d'améliorer la fixation des cellules pour les cellules connues pour attacher à la fibronectine in vivo 18. Substituer plus grandes protéines fibronectine aime avec de plus petits peptides qui ont la même fonctionnalité fournit une réduction significative des coûts.
Ici, peptide greffage chitosane a été réalisée comme précédemment publié 18. Comme cela est démontré plus haut, cette approche fournit un greffage simple et efficace en utilisant les agents de couplage EDC-HCl (1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) et du NHS (N – hydroxysuccinimide) fonctionnaliser l'acide carboxylique de MFG être greffé sur lefilm de chitosane. Deux avantages de ce procédé de greffage est qu'il ne nécessite aucune modification du chitosane ou du peptide, et il est utilisé en milieu aqueux afin de maximiser la compatibilité avec les futures applications de culture cellulaire 18,20. Étant donné que les agents de couplage et le peptide peuvent être chargés, C'est un procédé approprié pour l'analyse de la cinétique de la réaction. Fait important, l'analyse de la cinétique de réaction par l'intermédiaire de la CE permet la surveillance en temps réel de la réaction de greffage et permet ainsi à la fois l'optimisation et la quantification du taux de greffage.
Bien qu'il soit pas systématiquement nécessaire, les résultats de l'analyse de la CE peuvent être validées hors ligne par une mesure directe du peptide greffage sur les films de chitosane en utilisant l' état solide RMN (résonance magnétique nucléaire) spectroscopie 25,26 pour démontrer le greffage covalent du peptide sur le film 18. Cependant, par rapport à la spectroscopie RMN à l'état solide, l'analyse en temps réel fourni parCE permet la quantification de la consommation de peptides en temps réel, et donc la capacité d'évaluer la cinétique de la réaction.
Le procédé mentionné ci-dessus est simple et permet l'analyse en temps réel du peptide greffage sur des films de chitosane avec une quantification indirecte de la mesure de la greffe. La méthode illustrée peut être étendue à l'évaluation quantitative en temps réel des réactions chimiques différentes tant que les réactifs ou les produits à analyser peuvent être chargés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La simplicité du protocole décrit ici, il est parfaitement adapté à une application à grande échelle. Cependant, une attention particulière doit être accordée à des étapes clés suivantes.
Préparation des instruments de la CE Proper
Il est important de séparer une norme connue immédiatement avant la séparation des échantillons inconnus (ainsi qu'à la fin d'une série de séparations) pour vérifier la val…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
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