साथ प्रायोगिक संक्रमण<em> लिस्टेरिया monocytogenes</em> का अध्ययन होस्ट इंटरफेरॉन-γ जवाब के लिए एक मॉडल के रूप
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन लिस्टेरिया monocytogenes के EGD तनाव के साथ C57BL / 6J चूहों टीका लगाना करने के लिए कैसे (एल monocytogenes) और इंटरफेरॉन γ (IFN-γ) प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.), प्राकृतिक हत्यारा टी (NKT) कोशिकाओं द्वारा प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए, और अनुकूली टी के बाद संक्रमण लिम्फोसाइटों। इस प्रोटोकॉल का भी वर्णन कैसे रोगज़नक़ का एक संशोधित एलडी 50 खुराक के साथ संक्रमण के बाद चूहों में अस्तित्व के अध्ययन का संचालन करने के लिए।
Abstract
एल monocytogenes एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु मानव में खाद्य जनित रोग का एक कारण है। इस रोगज़नक़ के साथ चूहों की प्रायोगिक संक्रमण intracellular रोगजनकों के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा में सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं और विशिष्ट साइटोकिन्स की भूमिका पर बेहद जानकारीपूर्ण किया गया है। एल monocytogenes साथ sublethal संक्रमण के दौरान IFN-γ जन्मजात कोशिकाओं द्वारा की उत्पादन मैक्रोफेज और रोगज़नक़ 1-3 के प्रारंभिक नियंत्रण को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अनुकूली स्मृति लिम्फोसाइट द्वारा IFN-γ उत्पादन reinfection 4 पर सहज कोशिकाओं की सक्रियता भड़काना के लिए महत्वपूर्ण है। एल संक्रमण मॉडल monocytogenes इस प्रकार की जांच के लिए एक महान उपकरण के रूप में कार्य करता है कि क्या नए उपचारों कि IFN-γ उत्पादन बढ़ाने के लिए तैयार कर रहे हैं विवो में IFN-γ प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव पड़ता है और इस तरह के जीवाणु क्लीयरेंस बढ़ रही है या माउस अस्तित्व में सुधार के रूप में उत्पादक जैविक प्रभाव है सेसंक्रमण। यहाँ बताया कि कैसे एल monocytogenes के EGD तनाव के साथ C57BL / 6J चूहों की intraperitoneal के संक्रमण का संचालन करने और cytometry एन.के. कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं, और अनुकूली लिम्फोसाइट द्वारा IFN-γ उत्पादन प्रवाह से मापने के लिए के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल है। (1) बढ़ने और टीका के लिए बैक्टीरिया तैयार करते हैं, (2) प्लीहा और यकृत, और समापन के लिए (3) उपाय के पशु अस्तित्व में बैक्टीरियल लोड मापने: इसके अलावा, प्रक्रियाओं के लिए वर्णित हैं। प्रतिनिधि डेटा भी वर्णन कैसे इस संक्रमण मॉडल एल monocytogenes और इस संक्रमण से चूहों के अस्तित्व के लिए IFN-γ प्रतिक्रियाओं पर विशेष एजेंटों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान की जाती हैं।
Introduction
IFN-γ एक साइटोकाइन कि intracellular रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता में मध्यस्थता के लिए और 5 ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। बैक्टीरियल प्रतिरोध में इस साइटोकाइन के महत्व अवलोकन है कि साथ IFN-γ संकेतन मार्ग में परिवर्तन अत्यधिक माइक्रोबैक्टीरिया और salmonellae 6 के साथ संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, मनुष्यों में स्पष्ट है। इसी तरह, चूहों, या तो IFN-γ या IFN-γ रिसेप्टर प्रदर्शनी एल monocytogenes 10,11 माइक्रोबैक्टीरिया 7-9 और अन्य intracellular रोगजनकों के लिए प्रतिरोध में दोष सहित कमी लीशमैनिया प्रमुख 12, साल्मोनेला 13, और कुछ वायरस 11। Combatting रोगजनकों के अलावा, IFN-γ ट्यूमर 14 के खिलाफ मेजबान रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि IFN-γ के उच्च उत्पादन संक्रमण या कैंसर के संदर्भ में फायदेमंद है, यह साइटोकाइन के लंबे समय तक उत्पादन टी जोड़ा गया हैप्रणालीगत औतोइम्मुिनित 15-17 के विकास और प्रकार के त्वरण ओ मैं गैर-मोटे मधुमेह माउस मॉडल 18 में मधुमेह।
IFN-γ का प्रमुख स्रोत एन.के. कोशिकाओं, NKT कोशिकाओं, γδ टी कोशिकाओं, टी सहायक 1 (Th1) कोशिकाओं, और साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (सीटीएल) 5,19,20 शामिल हैं। IFN-γ द्वारा दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा को बढ़ाता है: (1) को विनियमन प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) वर्ग मैं और द्वितीय अभिव्यक्ति, (2) प्रतिजन कोशिकाओं पर सह उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति में वृद्धि, (3) बढ़ाने बृहतभक्षककोशिका phagocytosis और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन और microbicidal कारकों (जैसे, नाइट्रिक ऑक्साइड और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों), (4) Th1 प्रेरक कोशिकाओं में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने, (5) इम्युनोग्लोबुलिन के लिए एंटीबॉडी वर्ग परिवर्तन को बढ़ावा देने ( आईजी) 2A और IgG3 (माउस में), (6) मैं की साइटों के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती के लिए chemokines के उत्पादन उत्प्रेरणnfection, और (7) एन.के. सेल और सीटीएल प्रतिक्रियाओं 5,19 बढ़ाने। रोगजनकों और ट्यूमर के लिए मेजबान जवाब में IFN-γ के निर्णायक महत्व को देखते हुए, पुनः संयोजक IFN-γ विभिन्न संक्रमण और कैंसर (19 में समीक्षा) के लिए एक इलाज के रूप में परीक्षण किया गया है। हालांकि, क्योंकि IFN-γ या Th1 को बढ़ावा देने साइटोकाइन इंटरल्यूकिन 12 (आईएल -12) के प्रणालीगत प्रशासन साइड इफेक्ट के साथ जुड़ा हुआ है और खुराक से संबंधित विषाक्तता 19,21 जाता है, वहां वैकल्पिक रणनीतियों के विकास के द्वारा IFN-γ उत्पादन को बढ़ाने के लिए ब्याज है प्रतिरक्षा कोशिकाओं। नई जैविक और छोटे अणुओं के विकास परीक्षण करने के लिए इस तरह के एजेंटों के एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान IFN-γ उत्पादन बढ़ाने के लिए है कि क्या इन विवो स्क्रीनिंग उपकरण में की आवश्यकता है और इस तरह के पशु अस्तित्व में वृद्धि के रूप में सार्थक जैविक प्रभाव में तब्दील हो जाए।
ग्राम पॉजिटिव जीवाणु एल monocytogenes के साथ चूहों की प्रायोगिक संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई मॉडल किया गया हैintracellular रोगजनकों 1,22 के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा में IFN-γ की भूमिका का गूढ़ रहस्य। रोगज़नक़ नसों या intraperitoneally (आईपी) के साथ चूहों के संक्रमण प्लीहा और यकृत, जहां वे निवासी मैक्रोफेज और 3 और 4 दिनों के बाद के बीच होने वाली तिल्ली में चोटी जीवाणु भार के साथ hepatocytes से भली भाँति बनने के लिए बैक्टीरिया के तेजी से प्रसार करने के लिए सुराग संक्रमण 1,3,22। IFN-γ एन.के. कोशिकाओं द्वारा की उत्पादन बृहतभक्षककोशिका सक्रियण और रोगज़नक़ 3 के खिलाफ प्रारंभिक प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि उच्च संक्रामक खुराक पर, IFN-γ का उत्पादन भी रोगज़नक़ क्लीयरेंस 23 के लिए हानिकारक हो सकता है। NKT कोशिकाओं को भी रोगजनकों 2,24 के प्रारंभिक नियंत्रण के दौरान प्लीहा और यकृत में IFN-γ का स्रोत रहे हैं और इस उत्पादन एन.के. कोशिकाओं 2 सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं द्वारा IFN-γ उत्पादन बढ़ाना करने के लिए दिखाया गया है। दूसरी ओर, बाद में अभिनय अनुकूली टी lymphocytes, पार्टी में सीडी 8 + टी कोशिकाओंcular, रोगज़नक़ की निकासी मध्यस्थता और फिर से संक्रमण 1,4,22 के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
इस संक्रमण मॉडल कारणों की एक संख्या (1 में समीक्षा) के लिए शोधकर्ताओं के लिए आकर्षक हो गया है। सबसे पहले, रोगज़नक़ के साथ संक्रमण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और एक मजबूत Th1 और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया लाती है। दूसरे, sublethal संक्रमण के दौरान, बैक्टीरियल लोड जिगर और तिल्ली जहां यह आसानी से मापा जा सकता है में केंद्रित है। तीसरा, रोगज़नक़ सुरक्षित रूप से जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) की शर्तों के तहत नियंत्रित किया जा सकता है। चौथे, जीव और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया यह बड़े पैमाने पर किया गया विशेषता है उत्पन्न करता है। अंत में, उत्परिवर्ती और आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों की एक किस्म विकसित किया गया है कि प्रयोग के लिए उपलब्ध हैं।
यहाँ वर्णित है एल के EGD तनाव के साथ C57BL / 6J चूहों का टीका के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल 25 monocytogenes और IFN को मापने के लिए – γ फिर सेएन.के., NKT, और अनुकूली लिम्फोसाइटों के बाद संक्रमण से sponses। इसके अलावा बताया कि कैसे sublethal संक्रमण के बाद तिल्ली में बैक्टीरियल लोड और जिगर को मापने के लिए और रोगज़नक़ का एक संशोधित एलडी 50 खुराक के साथ संक्रमण के बाद अस्तित्व के अध्ययन के लिए बाहर ले जाने के लिए है। अंत में, प्रतिनिधि डेटा कैसे इस प्रोटोकॉल IFN-γ प्रतिक्रियाओं और माउस के अस्तित्व पर नए उपचार के प्रभाव स्क्रीन करने के लिए एल से संक्रमण monocytogenes इस्तेमाल किया जा सकता दिखाए जाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम कैसे बाहर एक बुनियादी प्रयोगात्मक संक्रमण के साथ ले जाने के लिए एल के EGD तनाव पुरुष या महिला C57BL / 6J चूहों में 25 monocytogenes के एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल विवो 31 में सहज और ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
References
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