La infección experimental con<em> Listeria monocytogenes</em> Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma
Summary
Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.
Abstract
L. monocytogenes es una bacteria gram-positiva que es una causa de enfermedad transmitida por alimentos en seres humanos. La infección experimental de ratones con este patógeno ha sido altamente informativo sobre el papel de las células inmunes innatas y adaptativas y citocinas específicas en la inmunidad del huésped contra los patógenos intracelulares. La producción de IFN-γ por las células innatas durante la infección subletal con L. monocytogenes es importante para la activación de los macrófagos y el control temprano del patógeno 1-3. Además, la producción de IFN-γ por los linfocitos de memoria de adaptación es importante para la imprimación de la activación de las células innatas a la reinfección 4. La L. monocytogenes modelo de infección por lo tanto sirve como una gran herramienta para investigar si las nuevas terapias que están diseñados para aumentar la producción de IFN-γ tener un impacto en las respuestas de IFN-γ in vivo y tienen efectos biológicos productivos, tales como el aumento de la eliminación de bacterias o la mejora de la supervivencia del ratón deinfección. Se describe aquí es un protocolo básico para cómo llevar a cabo las infecciones intraperitoneales de ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y para medir la producción de IFN-γ por las células NK, células NKT, y linfocitos de adaptación por citometría de flujo. Además, los procedimientos se describen a: (1) crecer y preparar las bacterias para la inoculación, (2) medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado, y (3) la supervivencia medida de los animales a los puntos finales. También se proporcionan datos representativos para ilustrar cómo este modelo de infección se puede utilizar para probar el efecto de agentes específicos en las respuestas de IFN-gamma a L. monocytogenes y la supervivencia de los ratones de esta infección.
Introduction
IFN-γ es una citoquina que es crucial para la mediación de la inmunidad contra los patógenos intracelulares y para controlar el crecimiento del tumor 5. La importancia de esta citocina en la resistencia bacteriana es evidente en la observación de que los seres humanos con mutaciones en la vía de señalización de IFN-γ son altamente susceptibles a la infección por micobacterias y salmonelas 6. De manera similar, los ratones deficientes en IFN-γ o los defectos de exhibición receptor de IFN-γ en la resistencia a las micobacterias 7-9 y otros patógenos intracelulares, incluyendo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13, y ciertos virus 11. Además de los agentes patógenos que combaten, IFN-γ juega un papel crucial en la defensa de huésped contra tumores 14. Aunque una mayor producción de IFN-γ es beneficioso en el contexto de la infección o el cáncer, la producción prolongada de esta citocina se ha relacionado to el desarrollo de autoinmunidad sistémica 15-17 y la aceleración de la diabetes tipo I en el modelo de ratón diabético no obeso 18.
Las principales fuentes de IFN-γ incluyen células NK, células NKT, delta gamma células T, células T auxiliares 1 (Th1) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto la inmunidad innata y adaptativa por: (1) hasta la regulación de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II expresión, (2) el aumento de la expresión de moléculas co-estimuladoras en las células presentadoras de antígeno, (3) los macrófagos mejora la fagocitosis y la producción de citoquinas pro-inflamatorias y microbicidas factores (por ejemplo, óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno), (4) la promoción de la diferenciación de células T CD4 + vírgenes en células efectoras Th1, (5) la promoción de cambio de clase de anticuerpo a la inmunoglobulina ( Ig) 2a y IgG3 (en el ratón), (6) la inducción de la producción de quimiocinas para reclutar células inmunes a sitios de iNFECCIÓN, y (7) el aumento de células NK y las respuestas de CTL 5,19. Dada la importancia crucial de IFN-γ en la respuesta del huésped a patógenos y tumores, IFN-γ recombinante ha sido probado como tratamiento para diversas infecciones y neoplasias (revisado en 19). Sin embargo, ya que la administración sistémica de IFN-γ o la citoquina Th1 promoción de la interleucina-12 (IL-12) está asociada con efectos secundarios y la toxicidad relacionada con la dosis 19,21, existe un interés en el desarrollo de estrategias alternativas para aumentar la producción de IFN-γ por células inmunes. El desarrollo de nuevos productos biológicos y moléculas pequeñas requiere herramientas de cribado in vivo para probar si tales agentes aumentan la producción de IFN-γ durante una respuesta inmune y si esto se traduce en efectos biológicos significativos tales como el aumento en la supervivencia animal.
La infección experimental de ratones con la bacteria L. monocytogenes gram positivas ha sido un modelo Instrumental paradescifrar el papel del IFN-γ en el huésped-inmunidad contra patógenos intracelulares 1,22. La infección de ratones con el patógeno por vía intravenosa o por vía intraperitoneal (ip) conduce a la rápida difusión de las bacterias en el bazo y el hígado, donde quedan internalizadas por los macrófagos residentes y los hepatocitos con cargas bacterianas pico en el bazo se producen entre 3 y 4 días post 1,3,22 infección. La producción de IFN-γ por las células NK es importante para la activación de macrófagos y la resistencia temprana contra el patógeno 3; Sin embargo, a dosis altas infecciosas, producción de IFN-γ también puede ser perjudicial para aclaramiento patógeno 23. Células NKT son también una fuente de IFN-γ en el bazo y el hígado durante el control temprano de patógenos 2,24 y esta producción se ha demostrado para amplificar la producción de IFN-γ por otros tipos de células incluyendo las células NK 2. Por otra parte, después de acción linfocitos T de adaptación, las células T CD8 + en particular, son importantes para mediar en la eliminación del patógeno y proporcionando protección contra 1,4,22 reinfección.
Este modelo de infección ha sido atractivo para los investigadores para una serie de razones (revisado en 1). En primer lugar, la infección con el patógeno es altamente reproducible e induce una fuerte respuesta inmune Th1 y celular. En segundo lugar, durante la infección subletal, la carga bacteriana se concentra en el hígado y el bazo en los que se puede medir fácilmente. En tercer lugar, el patógeno puede ser manejado con seguridad bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) condiciones. En cuarto lugar, el organismo y la respuesta inmune que genera se han caracterizado ampliamente. Por último, una variedad de cepas mutantes y genéticamente modificados han sido desarrollados que están disponibles para su uso.
Aquí se describe un protocolo básico para la inoculación de los ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y 25 para la medición de IFN – γ rerespuestas por NK, NKT, y los linfocitos de adaptación después de la infección. También se describe cómo medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado después de la infección subletal y para llevar a cabo estudios de supervivencia después de la infección con un LD 50 dosis modificada del patógeno. Finalmente, los datos representativos se muestran de cómo este protocolo se puede utilizar para detectar el efecto de los nuevos tratamientos en las respuestas de IFN-gamma y la supervivencia del ratón de L. monocytogenes infección.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un protocolo sobre cómo llevar a cabo una infección experimental básico con la cepa EGD de L. monocytogenes en 25 ratones C57BL / 6J macho o hembra. Este protocolo se creó con el fin de estudiar el efecto de una novela pequeña molécula IS001 en la producción de IFN-γ por los linfocitos innata y adaptativa in vivo 31. Mediante el control de la eliminación bacteriana y la supervivencia después de la infección, se adquirieron conocimientos sobre cómo est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
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